ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 3, с. 192-204
МОРФОГЕНЕЗ В РАЗВИТИИ
УДК 611.0139
РОЛЬ КОЛЛЕКТИВНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ДВИЖЕНИЙ И МЕХАНОГЕОМЕТРИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ В РАЗМЕТКЕ ОСЕВЫХ ЗАЧАТКОВ У ЗАРОДЫШЕЙ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ1
© 2007 г. Л. В. Белоусов, Е. Г. Корвин-Павловская, Н. Н. Лучинская, Е. С. Корникова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119892 Москва, ГСП-2, Ленинские горы E-mail: morphogenesis@yandex.ru Поступила в редакцию 03.08.06 г.
Исследовали роль коллективных клеточных движений в стабильной разметке маргинальной зоны у зародышей шпорцевой лягушки на осевые зачатки (хорду, сомиты и нервную ткань). Для этого на стадиях поздней бластулы-средней гаструлы производили следующие операции: 1) изоляцию маргинальной зоны; 2) добавление к ней фрагментов вентральной эктодермы; 3) разрезы изолированных маргинальных зон по вентральной (а) или дорсальной (б) средней линии; 4) ретрансплантацию супрабластопоральной области без поворота и с поворотом на 90°; 5) П-образную сепаровку супра-бластопоральной области в переднем или заднем направлениях. Обнаружено, что в опытах 1, 4 и 5 подавлялись латеромедиальные конвергентные движения клеток и дифференцировка осевых зачатков в супрабластопоральной области. В опытах 4 и 5 клеточные потоки направлялись в вентральном направлении, и полностью перестраивалась вся архитектура зародыша. Осевые зачатки располагались в основном в боковых губах бластопора. В опыте 3 конвергентные движения клеток восстанавливались, причем в (а) - в презумптивном направлении, а в (б) - перпендикулярно последнему. Осевые зачатки были вытянуты перпендикулярно направлениям конвергенции и, как правило, изогнуты. В последних случаях сомиты возникали на выпуклых (растянутых), а нервная ткань -на вогнутых (сжатых) сторонах. Анализ полученных данных показывает, что, по крайней мере, до стадии средней гаструлы в маргинальной зоне отсутствует стабильная разметка. Она устанавливается путем самоорганизации, в которой важную роль играют кооперативные клеточные движения и создаваемые ими механогеометрические условия.
Ключевые слова: Xenopus laevis, самоорганизация, гаструляция, осевые зачатки, клеточные движения, механические напряжения.
Согласно картам презумптивных зачатков (Gilbert, 2003), маргинальная зона (МЗ), кольцом опоясывающая бластопор (расположена между пунктирными контурами; см. рис. 1, а), "размечена", по крайней мере, на зачатки хорды, сомитов и боковой пластинки (последняя, по новейшим данным, еще более детализирована: Kumano, Smith, 2002), а спереди от хордального зачатка локализован материал нервной пластинки. В настоящее время классические морфологические карты можно дополнить картами экспрессии целого ряда генов, необходимых для дифференцировки тех или иных зачатков (Smith et al., 1991; Cho et al., 1991; Smith et al., 1995; Onichtchouk et al., 1996; Bouwmeester et al., 1996; Schroeder et al., 1999 и др). Часть генов экспрессируется локально, а часть -довольно широко, совпадая или нет с картами презумптивных зачатков для данной стадии. В любом случае, однако, остается неясным, како-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 05-04-48681).
вы факторы разметки, когда она становится необратимой и на чем основана ее структурная устойчивость, т.е. практически стопроцентная для нормального развития воспроизводимость и идеальная симметричность относительно сагиттальной плоскости.
Высказано мнение, что основными факторами разметки являются градиенты концентрации сек-ретируемых факторов, убывающие по мере удаления от шпемановского и ньюкуповского центров (см. например: Christian, Moon, 1993; Heas-man, 1997). Действительно, в опытах на агрегатах клеток ранней гаструлы показано, что по мере удаления от источника диффузии одного из индукционных факторов - активина - закономерно изменяется экспрессия ряда генов (Gurdon et al., 1994), а при изменении концентраций активина возникают различные зачатки - хорда, нервная ткань, мышцы, пронефрос и сердце (Arizumi, Asashima, 2001). Вместе с тем ни рисунок экспрессии генов в опытах Гердона, ни последовательность возникающих зачатков при убывающих
Рис. 1. Разметка маргинальной зоны (МЗ) зародышей амфибий (а) и схемы экспериментов (б-з). Зародыши показаны с вегетативного полюса. ( ): б-д - удаление энтодермы желточной пробки (заштрихована); (-*■): е - направление поворотов, ж, з - сепаровки материала супрабластопоральной области. Экт (в) - лоскут вентральной эктодермы, наложенный на эксплантат, Д-В (г, д) - дорсовентральная ось.
концентрациях активина в экспериментах Аризу-ми и Асашимы не были вполне идентичны соответствующим разметкам в нормальном развитии. Кроме того, используемые концентрации активина были значительно выше физиологических, а результаты описанных опытов сильно зависели от количества клеток в агрегате и носили пороговый характер, требующий межклеточных взаимодействий (Green et al., 1994).
Важно подчеркнуть, что интересующая нас дифференцировочная разметка (отражаемая на картах презумптивных зачатков) значительно тоньше и подробнее, нежели регистрируемая в процессе гаструляции разметка по признакам экспрессии генов. Например, экспрессирующий-ся в супрабластопоральной области (СБО) ген goosecoid метит плюрипотентные клетки (Niehrs et al., 1993), впоследствии дающие начало различным закладкам. Кроме того, этот ген контролирует коллективные гаструляционные движения, вовлекая в дифференцировку также и не экспрес-сирующие его клетки. В связи с этим авторы, ссылаясь на нашу предыдущую работу (Beloussov et al., 1988), прямо ставят вопрос об участии мор-фогенетических движений в установлении терминальной дифференцировки клеток. На это же указывают опубликованные позже работы (Sokol, 1994; Yamada, 1994). Кроме того, важным доводом против предварительной (наступающей до клеточных движений) спецификации клеток
является их существенное перемешивание в ходе движений (Dale, Slack, 1987; Shih, Keller, 1992). Ясно, что в этих условиях более ранняя детерминация была бы неэффективной.
Фундаментальным, но нередко игнорируемым свойством разметки зародыша является ее структурная устойчивость, т.е. способность к точному восстановлению после значительных нарушений во взаиморасположении целых зачатков и отдельных клеток (Саксен, Тойвонен, 1963), а также расширение спектра дифференцировок при увеличении объема образца (Lopashov, 1935). Эти явления трудно объяснимы с позиций концентрационных градиентов и повышают вероятность поздней спецификации клеток, которая должна быть тесно связана с их коллективными взаимодействиями.
Задача нашего исследования состояла в изучении роли коллективных клеточных движений и связанных с ними механогеометрических факторов (полей механических напряжений) в разметке маргинальной зоны зародыша и становлении архитектуры зародыша в целом. С этой целью были использованы различные приемы модуляции полей механических напряжений и, соответственно, изменений направления клеточных потоков. Особое внимание уделяли проявлениям самоорганизации в ходе развития.
Рис. 2. Дифференцировка изолированных МЗ (а-в), фрагментов вентральной эктодермы (г-е) и изолированной МЗ, сращенной с лоскутом вентральной эктодермы (ж, з). Операции проведены на ст. 10, материал фиксирован через 1824 ч. ( —) - впячивания.
НТ - нервная ткань, X - хорда. Пунктирная кривая (•) ограничивает область, занятую недифференцированными клетками. Масштаб: а, г, ж, з - 1 мм, б, в, д, е - 200 мкм.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовали зародыши шпорцевой лягушки (Xenopus laevis Daudin), полученные методом гормональной стимуляции производителей. Микрохирургические операции проводили на стадиях 9-12 (поздняя бластула - поздняя га-струла) по Ньюкупу и Фаберу (Nieuwkoop, Faber, 1956) в следующих вариантах.
1. На стадии 10+ эксплантировали МЗ, т.е. экваториальную область зародышей X. laevis, лежащую анимальнее закладки бластопора. Материал желточной пробки удаляли (рис. 1, б, стрелка). Отдельно эксплантировали оставшийся в зародыше анимальный (эктодермальный) материал.
2. Накрывали МЗ с анимальной стороны немедленно после ее эксплантации лоскутом вентральной эктодермы (рис. 1, в, Экт).
3. Разрезали МЗ немедленно после ее изоляции либо по вентральной (серия а), либо по дорсальной (серия б) средней линии (рис. 1, г, д).
4. Вырезали СБО (3-4 клеточных слоя) и немедленно (через несколько секунд) ретрансплан-тировали ее в то же положение на тот же самый или другой зародыш той же стадии без поворота или с поворотом трансплантата на 90° (рис. 1, е).
5. Проводили П-образную сепаровку СБО в направлении либо на бластопор (серия а), либо от бластопора (серия б) (рис. 1, ж, з). Во избежание немедленного зарастания раны такие сепаровки повторяли трижды в течение первых двух часов.
Культивирование зародышей и эксплантатов. Образцы инкубировали до 24 ч при комнатной температуре в пластиковых чашках на ага-розных субстратах в растворе MMR, мМ (100 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 5 HEPES, pH 7.4) с
Рис. 3. Движения материала экспериментальных образцов (а, в-з) в сравнении с нормальной гаструляцией (б) на основе наблюдений над угольными (а-в, е) и ФД- метками (г, д, ж, з). Стрелки соединяют начальные и конечные положения угольных меток за 3-часовой период после эксплантации (а, в, е) и за тот же период нормальной гаструляции (•). а - опыт 1; в-д - опыт 3, а: г - ФД-метка в потомстве дорсомедиальных бластомеров сразу после вентрального разреза, д - тот же образец через 3 ч, метка концентрируется вдоль дорсомедиальной оси; е-з - опыт 3, б: ж - ФД-метка в потомстве вентромедиальных бластомеров через 30 мин после дорсального разреза, з - тот же образец через 15 ч, метка растягивается вдоль его длинной оси. Масштаб: а - в, е - 400 мкм, г, д, ж, з - 1 мм.
добавлением гентамицина. Через 40 мин после завершения операций раствор разбавляли вдвое. Для маркировки клеточных движений использовали два метода.
1. На образцы, закрепленные в агарозных лунках, наносили взвесь угольных частиц. При помощи фотокамеры Canon с использованием программы Adobe Photoshop 7.0 про
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.