= ОБЗОРЫ
УДК 577.15
РОЛЬ Ки-АНТИГЕНА В РЕПАРАЦИИ АПУРИНОВЫХ/АПИРИМИДИНОВЫХ САЙТОВ В ДНК
© 2015 г. А. А. Косова1, О. И. Лаврик12, С. Н. Ходырева12*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 2Новосибирский государственный университет, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию и принята к печати 18.08.2014 г.
Апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты — одни из наиболее распространенных повреждений геномной ДНК. Считается, что независимо от способа возникновения АР-сайты подвергаются репарации по механизму эксцизионной репарации оснований (ЭРО) и представляют собой ключевые интермедиаты этого процесса. При определенных условиях белки, распознающие АР-сайты, могут формировать кова-лентные аддукты с ДНК. С помощью комбинации метода боргидрид-зависимой сшивки и масс-спектро-метрического анализа выявлено взаимодействие с АР-сайтами Ки-антигена — ключевого белка негомологичного соединения концов (НГСК), одного из путей репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Кроме того, установлено, что Ки-антиген обладает 5'^ЯР/АР-лиазной активностью, которая реализуется в процессе НГСК. Недавно показано, что Ки-антиген участвует в различных стадиях ЭРО. В данном обзоре рассматриваются функции Ки-антигена в двух путях репарации ДНК: НГСК и ЭРО.
Ключевые слова: Ки-антиген, апуриновый/апиримидиновый сайт, негомологичное соединение концов, эксцизионная репарация оснований.
THE ROLE OF Ku ANTIGEN IN THE REPAIR OF APURINIC/APYRIMIDINIC SITES IN DNA, by A. A. Kosova1, O. I. Lavrik1'2, S. N. Khodyreva1'2* ^Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia; 2Novosibirsk State University, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: svetakh@niboch.nsc.ru). Apurinic/apyrimidinic (AP) sites are some of the most frequent lesions in genomic DNA. It is widely accepted that, irrespective of their origin, AP sites are further processed by the base excision repair (BER) machinery, being the central intermediate of this process. Under special conditions, proteins, which recognize AP sites, are able to form covalent adducts with DNA. By combination of the cross-linking technique with mass-spectrometry analysis, Ku antigen (Ku) — the central player in nonhomologous end joining (NHEJ), the pathway of double-strand break (DSB) repair — was identified as a protein reactive to AP sites. Moreover, Ku was shown to be a 5'-dRP/AP lyase that acts near DSBs in NHEJ. The recent studies have demonstrated involvement of Ku in the different stages of BER. Here, Ku roles in NHEJ and BER pathways of DNA repair are overviewed.
Keywords: Ku antigen, apurinic/apyrimidinic site, nonhomologous end joining, base excision repair.
Б01: 10.7868/80026898415010073
ВВЕДЕНИЕ
Апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты, возникающие в клетках млекопитающих с частотой от 10000 до 50000 раз в сутки, — одни из наиболее распространенных повреждений геномной ДНК [1]. Число АР-сайтов может значительно увеличиваться в условиях стресса, таких как воздей-
ствие рентгеновского или УФ-излучения, окислительных и алкилирующих агентов. Нерепари-рованные АР-сайты мутагенны и цитотоксичны [2]. Потеря оснований ДНК и последующее формирование АР-сайтов происходят путем спонтанного гидролиза М-гликозидной связи или в результате катализируемого ДНК-гликозилазами удаления поврежденных оснований на ранней
Принятые сокращения: АР-сайт — апуриновый/апиримидиновый сайт; АРЕ1 — апуриновая/апиримидиновая эндонукле-аза 1; (!КР — дезоксирибозофосфат; Ро1р — ДНК-полимераза Р; ЭРО — эксцизионная репарация оснований; НГСК — негомологичное соединение концов; ДНК-ПК — ДНК-зависимая протеинкиназа.
* Эл. почта: svetakh@niboch.nsc.ru
67
5*
OH
Рис. 1. Пути расщепления AP-сайта в процессе ЭРО.
стадии процесса эксцизионной репарации оснований (ЭРО) [3]. Стационарный уровень АР-сайтов в клетках млекопитающих составляет приблизительно 1 повреждение на 106 н. [4]. В основном репарация АР-сайтов происходит с очень высокой скоростью [5]. В то же время часть АР-сайтов может присутствовать в геномной ДНК в течение довольно длительного времени [6]. В связи с этим возникает вопрос о природе этих медленно репарируемых АР-сайтов и о механизмах быстрой и отложенной репарации данных повреждений. Считается, что независимо от механизма возникновения АР-сайты репарируются системой ЭРО (рис. 1). В большинстве случаев репарация АР-сайтов начинается с гидролиза фосфодиэфирной связи с 5'-стороны от АР-сайта — катализирует этот процесс апуриновая/апиримиди-новая эндонуклеаза 1 (АРЕ1) [7]. АР-сайты также могут расщепляться ДНК-гликозилазами или другими ферментами, имеющими АР-лиазную активность, по механизму в- или Р,8-элиминирования [3, 7]. В этих случаях происходит расщепление фосфодиэфирной связи с З'-стороны от АР-сайта с образованием а, в-ненасыщенного альдегида (а,в-4-гидроксипентен-2-аля) на З'-конце и фосфатной группы на 5'-конце (в-элиминирова-ние) или фосфатных групп на 3'- и 5'-концах (в,8-элиминирование). Эти интермедиаты про-цессируются ферментами ЭРО на последующих стадиях [7]. По-видимому, по этому механизму происходит репарация изолированных АР-сайтов, которые возникают при умеренном уровне
повреждений ДНК. Однако при воздействии некоторых сильных стрессовых факторов, таких как ионизирующее излучение, AP-сайты могут возникать в составе множественных повреждений (называемых еще кластерными повреждениями), которые также включают двухцепочечные и од-ноцепочечные разрывы и окисленные основания [8, 9]. Действительно, установлено, что в дополнение к двухцепочечным разрывам (основной тип повреждений), возникающим при воздействии излучения, характеризуемого высокой линейной передачей энергии (high linear energy transfer), наиболее часто представлены AP-сайты в пределах 8—10 п.н. от концов разрыва [10]. Возможно, в узнавании и репарации AP-сайтов в контексте комплексных повреждений участвуют особые белки.
Основываясь на этом предположении, мы провели поиск белков, способных связываться с AP-ДНК, в клеточных экстрактах. Остатки дезок-сирибозы в составе AP-сайтов находятся в равновесии между циклической (фуранозной) и ациклической (альдегидной) формами [4]. Альдегидная форма AP-сайта может образовывать с аминогруппой белка интермедиат — основание Шиффа (рис. 2). Формирование основания Шиффа — обратимый процесс, но интермедиат можно стабилизировать, восстанавливая его боргидридом натрия [11]. Получающийся ковалентный аддукт белок-ДНК стабилен в условиях последующего анализа. Таким образом, "сшивку" белков с АР-сайтами в комбинации с масс-спектрометрией можно при-
0
II
O-P-O—
1
O-
H
ДНК-O
O
:-о н
0 и
o-p-o—
1
O-
OH H
HH
ДНК-O
o-p-o—
I
O-
OH
HMTi
ДНК-O
NaBH4
0
II
"O-P-O—I
1
O
N i
Белок
H-N-H
i
Белок
.OH H H
H | I Белок
[К-O H
Н ДНК-О
Рис. 2. Схема образования основания Шиффа и его восстановления боргидридом натрия.
+
О
кг) v
с
Сшивка
Белки клеточного экстракта
АР-ДНК с биотином и радиоактивной меткой
Адсорбция
Отмывка
Ковалентный аддукт ДНК-белок
3
за
■С
Si
100
Результаты поиска Top score: 114 for (KU80_HUMAN)
Protein scores greater than 61 are significant (p < 0.05)
L
ж
105 110 115
Probability Based Mouse Score
MALDI-TOF-MS
w
LJ
0
0
900 1070 1240 1410 1580 1750 mass
Рис. 3. Схема идентификации белков, способных взаимодействовать с AP-сайтами путем формирования основания Шиффа. Пояснения см. в тексте.
менять для поиска и идентификации неизвестных белков, которые могут взаимодействовать с этим повреждением ДНК [12].
Идентификация белков, способных взаимодействовать с АР-сайтами путем формирования основания Шиффа, включает следующие этапы (рис. 3). Сначала проводят в препаративных количествах сшивку белков клеточного экстракта с
32Р-меченой АР-ДНК, содержащей остаток биотина. Затем осуществляют очистку "пришитых" белков с помощью аффинной хроматографии на парамагнитных частицах, покрытых стрептави-дином, и разделяют белки с помощью электрофореза в присутствии SDS. Полосу белка, видимую по окрашиванию Кумасси и точно соответствующую полосе на радиоавтографе, вырезают из геля.
Белок непосредственно в геле подвергают исчерпывающему трипсинолизу и экстрагированные пептиды анализируют MALDI-TOF масс-спек-трометрией. По результатам масс-спектрометри-ческого анализа проводят поиск белка в базах данных. Следует подчеркнуть, что в данном методе AP-сайты играют две роли, будучи одновременно естественными повреждениями ДНК и химически активными группами, обеспечивающими образование ковалентных аддуктов с ДНК.
Используя вышеизложенный подход, мы идентифицировали полипептид, связывающийся с AP-ДНК, как Ки80-субъединицу Ku-антигена [13]. И этот результат был неожиданным, так как до сих пор считалось, что Ku-антиген участвует в негомологичном соединении концов (НГСК) [14] — системе репарации ДНК, которая не осуществляет репарацию AP-сайтов. Так что, выявив неожиданную активность Ku80 — способность взаимодействовать с AP-сайтами, т.е. интермедиатами ЭРО, далее следовало ответить на вопрос о биологической роли этого взаимодействия.
Ku-АНТИГЕН
Ku-антиген высших эукариот, состоящий из двух субъединиц с молекулярными массами около 70 кДа (Ku70) и 83 кДа (Ku80), - это ДНК-свя-зывающий компонент ДНК-зависимой протеин-киназы (ДНК-ПК). Холофермент ДНК-ПК помимо Ku-антигена содержит еще каталитическую субъединицу. Главная функция Ku-антигена заключается в участии в репарации двухцепочеч-ных разрывов путем НГСК. Связываясь с ДНК по принципу "бусина на нитке", Ku-антиген распознает концы двухцепочечного разрыва и сближает их [15]. Ku-антиген служит платформой для сборки других белков НГСК около двухцепочечного разрыва [14]. Следует отметить, что Ku-ан-тиген — многофункциональный белок. Он участвует не только в классическом НГСК, но и в поддержании целостности теломер, регуляции репликации и транскрипции, а также в процессе У^^-рекомбинации, ответственном за первичное антиген-независимое разнообразие иммуноглобулинов. Ku-антиген так
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.