ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.224
РОЛЬ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ПРОМУТАГЕНОВ В ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ ГЕНОМА ПРИ ОЛЬФАКТОРНОМ СТРЕССЕ У ДОМОВОЙ МЫШИ Mus musculus
© 2011 г. А. С. Жук1, Е. И. Степченкова1 2, А. В. Дукельская1, Е. В. Даев1, С. Г. Инге-Вечтомов1,2
1Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции, Санкт-Петербург 199034
e-mail: ania_zh@mail.ru
2Учреждение Российской академии наук Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Санкт-Петербург 199034 Поступила в редакцию 28.02.2011 г.
Проверяли гипотезу о существовании связи между повышенной частотой возникновения митоти-ческих нарушений в делящихся клетках костного мозга и изменением активности фракции печени S9, содержащей ферменты активации промутагенов, при ольфакторно-индуцированном стрессе у домовой мыши Mus musculus. Для этого оценивали влияние феромона 2,5-диметилпиразина на частоту митотических нарушений в клетках костного мозга мышей ана-телофазным методом. Параллельно проводили сравнение активности фракции печени S9 стрессированных и нестрессирован-ных животных по их способности превращать промутаген 2-аминофлуорен в мутагенную форму в тесте Эймса с использованием Salmonella typhimurium. Показано, что возрастание частоты митотических нарушений в клетках костного мозга у самцов домовой мыши, индуцированное ольфактор-ным стрессором, сопровождается повышением активирующей способности фракции печени S9, которая преобразует промутагены в мутагены. Использованная модельная система позволила оценить последствия воздействия ольфакторного стрессора на генетическом уровне и предположить возможные механизмы дестабилизации генома при стрессе.
Воздействие природных или антропогенных факторов может приводить к развитию стресс-реакции, одним из признаков которой у млекопитающих является изменение работы нейро-эндокрин-но-иммунной системы [1]. По окончании кратковременного стресса наступает адаптация организма к меняющимся условиям окружающей среды. В то же время длительное воздействие стрессоров представляет серьезную угрозу для организма человека и животных [2]. Стрессоры оказывают существенное влияние на физическое и психическое здоровье человека посредством изменения целого ряда характеристик нервной, сердечно-сосудистой, эндокринной, репродуктивной и иммунной систем. В многочисленных исследованиях была показана связь между стрессом и повышенным риском развития различных заболеваний у человека [3, 4]. Среди них болезни сердца, желудочно-кишечного тракта, иммунной и репродуктивной систем [4, 5]. Выявлена ассоциация стрессовых состояний с инфекционными и воспалительными процессами, раком, герпесом и психическими расстройствами [6, 7]. У животных стрессоры оказывают негативное влияние на генетический аппарат как соматических, так и половых клеток, что может отражаться на численности и генетической структуре популяций [8—10]. Это определяет актуальность изучения молекулярно-генетических механизмов развития стресс-реакции.
Одной из удобных моделей для изучения стресс-реакции у млекопитающих является ольфакторно индуцированный стресс у домовой мыши Mus musculus. В этом случае стрессирующим фактором являются феромоны — биологически активные вещества, выделяемые животными во внешнюю среду и обеспечивающие хемокоммуникацию между ними. Показано, что воздействие феромоном 2,5-диме-тилпиразином (2,5-ДМП) на домовых мышей вызывает угнетение иммунной и репродуктивной систем, а также приводит к дестабилизации генетического аппарата соматических и половых клеток [11]. Цитогенетические эффекты, индуцированные феромонами, относительно мало изучены. Однако показано, что хемосигналы могут индуцировать мито-тические нарушения в клетках костного мозга мышей и хромосомные аберрации в сперматоцитах I и II порядка [11, 12]. Молекулярно-генетические механизмы нарушений, наблюдаемых при стрессе, в том числе влияние стрессоров на генетический материал клетки, изучены недостаточно. Мы предполагаем, что одним из механизмов индукции митотических нарушений в клетках костного мозга может быть изменение активности ферментов печени и в первую очередь белков семейства цитохромов Р450, отвечающих за детоксикацию промутагенов. Для проверки этой гипотезы была разработана экспериментальная модель, включающая в себя два объекта: домовую мышь Mus musculus и бактерию
Фиксация костного мозга и печени
Приготовление
препаратов костного мозга
Получение фракции S9 из печени
Подсчет уровня митотических нарушений в клетках костного мозга ана-телофазным методом
Оценка способности фракции S9 активировать промутаген 2-АФ в тесте Эймса
Рис 1. Общая схема эксперимента.
Salmonella typhimurium. С использованием этой модели мы оценивали влияние стрессора на генетический аппарат делящихся клеток костного мозга мышей ана-телофазным методом и на способность фракции печени S9 активировать промутаген 2-аминофлуорен (2-АФ) в тесте Эймса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проводили на половозрелых самцах домовой мыши Mus musculus L. высокоинбред-ной линии CBA (возраст 3—4 мес, масса тела 22— 24 г), полученных из питомника "Рапполово" АМН РФ. Общая схема эксперимента приведена на рис. 1. Самцов содержали группами по пять особей в стандартных пластиковых клетках со свободным доступом к еде и воде. В опытном и контрольном
вариантах использовали по 10 животных. Условия содержания были одинаковыми в контрольном и опытном вариантах. В качестве подстилки использовали опилки. После получения животных из питомника их содержали в лаборатории, не подвергая каким-либо воздействиям, в течение 10 дней для адаптации к условиям содержания. Затем опытную группу животных подвергали процедуре феромо-нального стрессирования. В клетки с подопытными животными вне пределов их досягаемости помещали перфорированную капсулу с ватным тампоном, на который наносили 1 мл 0.01%-ного раствора 2,5-ДМП. Используемая концентрация близка к естественной концентрации феромона (0.002—0.008%) в моче самок в условиях повышенной плотности содержания [13]. Контакт с феромоном происходил только посредством обоняния. Контролем служила
РОЛЬ метаболической активации
1359
Таблица 1. Частота митотических нарушений в клетках костного мозга самцов мышей линии СВА через 24 ч после воздействия 2,5-ДМП
Вариант воздействия Число животных Число клеток Частота нарушений митоза, %
нормальных с перестройками
Контроль 10 2000 68 3.3 ± 0.2
2,5-ДМП 10 2000 132 6.2 ± 0.4*
* Отличия от контроля достоверны (точный критерий Фишера, Р< 0.05).
группа мышей, в клетку к которым помещали капсулу с дистиллированной водой. Через 24 ч после начала воздействия 2,5-ДМП производили забор и фиксацию биологического материала (рис. 1).
Костный мозг фиксировали в смеси этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3 : 1 не менее часа и хранили в холодильнике при температуре 1—4°С до момента приготовления препаратов. Печень замораживали в жидком азоте и хранили при температуре — 70°С до использования образцов в тесте Эймса.
Оценку частоты митотических нарушений в делящихся клетках костного мозга проводили ана-те-лофазным методом, описанным ранее [12]. Учитывали такие типы нарушений, как "одиночный мост", "одиночный фрагмент" и "отставшая хромосома". При наличии в одной клетке двух и более нарушений их относили к классу "множественные перестройки".
Основными ферментами фракции S9 являются цитохромы P450, отвечающие за детоксикацию экзогенных или эндогенных соединений. Некоторые из них в результате химических модификаций пре-обретают мутагенные свойства. Таким образом, показателем активности цитохромов Р450 может являться эффективность активации промутагенов. Сравнение способности фракции S9 печени стрес-сированных и нестрессированных животных активировать промутаген 2-АФ проводили с помощью теста Эймса согласно стандартному протоколу [14], с незначительными модификациями, состоящими в том, что объем фракции S9 в микросомной активирующей смеси составлял 0.1 мл вместо 0.3 мл. Использовали раствор 2-АФ в диметилсульфоксиде (ДМСО). Концентрация 2-АФ составила 20 мкг на чашку. Об активности ферментов, содержащихся во фракции S9, судили по уровню мутагенеза, индуцированного у Salmonella typhimurium (штамм ТА98) под действием 2-АФ. Из контрольной и опытной групп животных случайным образом сформировали пары для сравнения в тесте Эймса. Мы провели 10 экспериментов, в которых проводили попарное сравнение способности фракции S9 печени стрес-сированных и нестрессированных мышей активировать промутаген 2-АФ в тесте Эймса (рис. 2).
Статистическую обработку результатов по подсчету митотических нарушений начинали с предва-
рительной проверки материала на внутригруппо-вую гомогенность: оценку проводили с помощью таблиц сопряженности ч2. В случае гомогенности данных в пределах группы их объединяли. Достоверность различий оценивали с помощью точного критерия Фишера. Различия считали достоверными при уровне значимости Р < 0.05. Для наглядности вычисляли частоты выявленных нарушений в процентах с ошибкой.
Достоверность различий результатов теста Эймса оценивали с помощью тестов Манна—Уитни, критерия Краскела—Уоллиса с уровнем значимости Р< 0.05 и критерия знаков для одной выборки [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Показано, что 2,5-ДМП оказывает негативное влияние на стабильность генетического аппарата делящихся клеток костного мозга у самцов домовой мыши: частота митотических нарушений при действии 2,5-ДМП возрастает примерно в 2 раза по сравнению с частотой в контрольном варианте (табл. 1).
В присутствии ольфакторного стрессора нарушается целостность хромосомного аппарата делящихся клеток костного мозга и процесс расхождения хромосом, на что указывает высокая частота таких типов нарушений, как "одиночный мост" и "множественные перестройки", включающие в себя множественные мосты и отставшие хромосомы (табл. 2). Одиночные мосты были наиболее частым типом нарушений и составили почти половину всех перестроек. По остальным двум типам перестроек, двойной мост и отставшая хромосома, достоверных различий между опытной и контрольной группами выявлено не
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.