ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 6, с. 668-684
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 575.1:599.9
РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ХРОМОСОМЫ 3 И ГЕНОВ микроРНК ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ
ПОЧЕЧНОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ
© 2015 г. Э. А. Брага1, 2, Д. С. Ходырев3, В. И. Логинов1,2, И. В. Пронина1,2, В. Н. Сенченко4, А. А. Дмитриев4, А. А. Кубатиев1, Н. Е. Кушлинский5
Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии, Москва 125315
e-mail: eleonora10_45@mail.ru 2Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 115478 3Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России, Москва 115682 4Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991 5Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва 115478 Поступила в редакцию 13.11.2014 г.
Метилирование CpG-островков промоторных районов и взаимодействие микроРНК с матричными РНК генов-мишеней на посттранскрипционном уровне относятся к совокупности эпигенетических механизмов, которые осуществляют тонкую и динамичную регуляцию генов и сигнальных путей клетки. В этом обзоре обобщены результаты авторов и данные литературы о роли метилирования в регуляции белок-кодирующих генов хромосомы 3 и ряда генов микроРНК в опухолях больных светлоклеточным почечноклеточным раком. Результаты основаны на применении геномных NotI-микрочипов, позволяющих выявлять одновременно метилирование и делеции в генах, содержащих CpG-островки, а также других подходов. Анализ короткого плеча хромосомы 3 в области частых делеций в опухолях позволил впервые идентифицировать ряд генов, ассоциированных с патогенезом рака почки. Показана связь изменений уровня экспрессии и метилирования генов хромосомы 3 с прогрессией рака почки и метастазированием. Идентифицированы также новые микроРНК, задействованные в патогенезе рака почки. Обсуждены функции генов микроРНК, метилируемых в опухолях почки.
DOI: 10.7868/S0016675815050021
Почечноклеточный рак (ПКР) составляет 90% опухолей почки и характеризуется наибольшей частотой летальных исходов среди урогениталь-ных видов рака [1]. Ежегодно в мире регистрируется 270 тыс. новых случаев ПКР и 116 тыс. смертей, что позволяет считать это заболевание одной из важнейших проблем онкоурологии [2, 3]. Только в России за 2010 г. выявлено почти 19 тыс. новых случаев ПКР, что составляет 3.6% от общего числа зарегистрированных случаев злокачественных новообразований [4]. Частота выявления ПКР постоянно растет во многих странах. Так, в России с 2000 до 2010 г. число выявленных за один год случаев увеличилось на 41%. Светлоклеточ-ный почечноклеточный рак (скПКР) встречается наиболее часто (70—80%) и протекает клинически более агрессивно по сравнению с папиллярным и хромофобным раком почки. Обычно скПКР имеет тенденцию не вызывать симптомы на ранних стадиях и примерно у трети пациентов диагностируют заболевание с метастазами, а у 50% больных метастазы развиваются после операции [3]. Поскольку химиотерапия мало эффективна при
скПКР, средняя продолжительность жизни пациентов с метастазами составляет немногим более года, а 5 лет переживают менее 10% больных скПКР [2]. Идентификация новых генов, связанных с патогенезом скПКР, и изучение механизмов их регуляции открывают возможности для выявления современных диагностических, прогностических маркеров и мишеней целенаправленной ("таргет-ной") терапии скПКР.
Регуляция экспрессии генов осуществляется на различных уровнях и ее механизмы разнообразны. Определение организации и механизмов функционирования регуляторных сетей клетки представляет на сегодня одну из приоритетных проблем функциональной геномики [5, 6]. Эпигенетические механизмы в комплексе с генетическими (мутациями генов и хромосомными аберрациями) ответственны за регуляцию активности генов и сигнальных путей клетки. Их роль особенно значима в процессах дифференцировки клеток при эмбриогенезе, в процессах старения и формирования фенотипа трансформированной клетки [7, 8]. Наряду с "гистоновым кодом" и ре-
гуляторными белковыми комплексами аномальное метилирование ДНК является важнейшим механизмом эпигенетической регуляции экспрессии [9]. Многие работы посвящены определению профилей метилирования специфичных наборов генов для определенных видов злокачественных опухолей или так называемых "ДНК гиперметилом" [10, 11]. В настоящее время уже имеются первые разработки полногеномного скрининга метилируемых генов с помощью се-квенирования бисульфит-модифицированных геномов опухолевых клеток человека. Разработка технологии микрочипов позволила расширить возможности такого рода исследований — тестированию подвергают сотни генов, среди которых обнаружены гены с аберрантным метилированием в 50—80% опухолей. К таким генам относятся, например, гены группы MINT (Methylated IN Tumors). Принципиально новые геномные NotI-микрочипы, разработанные в Каролинском институте (Швеция), позволили тестировать одновременно метилирование и делеции в генах, содержащих CpG-островки [12, 13]. Применение этой методологии к анализу короткого плеча хромосомы 3 (3p) — области экстремально частых де-леций в опухолях — помогло идентифицировать много новых генов, связанных с патогенезом эпителиальных опухолей легкого, яичников, шейки матки и почки [14—18].
В рамках проекта ENCODE построена объединенная регуляторная метасеть, в которой учтено участие и взаимодействие всех известных регуля-торных элементов генома человека, включая микроРНК (миРНК) [5, 6]. Взаимодействие миРНК с матричными РНК генов-мишеней на посттранскрипционном уровне осуществляет тонкую и динамичную регуляцию сигнальных путей клетки. Важное свойство миРНК — обширный диапазон мишеней. Каждая миРНК может участвовать в регуляции сотни белок-кодирую-щих генов, и, наоборот, структурный ген обычно представляет мишень для набора миРНК (см., например, miRWalk [19]). Эпигенетическая инактивация генов, ассоциированная с метилированием промоторных CpG-островков, характерна и для генов миРНК. Метилирование генов миРНК достаточно подробно изучено в эпителиальных опухолях разных локализаций (см. обзор [20]). Исследования метилирования генов миРНК при скПКР ограничиваются отдельными публикациями и касаются, главным образом, генов семейств miR-9 и miR-34 [21, 22].
В настоящем обзоре обобщены результаты авторов и данные литературы о роли метилирования в регуляции белок-кодирующих генов 3p и генов миРНК в опухолях больных скПКР. Показана связь изменения уровня экспрессии и метилирования генов 3p и ряда генов миРНК с прогрессией рака и метастазированием.
ГЕНЫ В РАЙОНАХ ЧАСТЫХ ДЕЛЕЦИЙ КОРОТКОГО ПЛЕЧА ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА
Более 20 лет назад было показано, что среди прочих хромосомных районов короткое плечо хромосомы 3 человека (3p) с наибольшей частотой (до 90%) подвержено аллельным и гомозиготным делециям в опухолях больных скПКР и мелкоклеточным раком легкого. Кроме того, фрагменты 3p могут подавлять рост культур опухолевых клеток [23]. Методами LOH и ПЦР в реальном времени с участием авторов картированы критичные районы 3p, наиболее часто повреждаемые в опухолях: LUCA (3p21.31), AP20 (3p21.33) и MECA3 (интервал D3S2409-D3S3667, 3p21.31), а также дистальные (3р26-р23) и проксимальные районы (3р14-р12), в том числе участок ломкости хромосомы 3 — FRA3B, содержащий ген FHIT (3р14.2), а также район частых гомозиготных де-леций в области 3р12.2 [24—30]. В этих районах определены многочисленные гены-супрессоры, потенциальные протоонкогены и другие гены, ассоциированные с развитием скПКР и эпителиальных опухолей других локализаций (рис. 1).
Гены в районах LUCA (3p21.31) и AP20 (3p21.33-p22)
В составе "критичного" района LUCA (LUng CAncer) идентифицирован протяженный кластер генов-супрессоров, часто инактивируемых в карциномах легкого, скПКР и опухолях других локализаций (см. обзоры [31—38]). Для многих генов этого района обнаружено гиперметилирование и снижение уровня экспрессии в опухолях, а также получено подтверждение их функциональной супрессорной активности. К наиболее изученным из них относят гены-супрессоры RASSF1A и SEMA3B.
Ген RASSF1A отличает многообразие функций в клетке, например, регуляция клеточного цикла, участие в индукции апоптоза за счет взаимодействия с продуктом онкогена ras или гена MST1, стабилизация микротрубочек [39] и др. Супрес-сорная активность гена RASSF1A показана in vitro и in vivo с использованием разных методов, в том числе с помощью нокаут-мутаций гена в клетках мыши [40, 41]. Нами впервые установлено, что промоторный район гена RASSF1A часто метилирован в клеточных линиях и первичных опухолях почки. Методом Нозерн-гибридизации показано отсутствие мРНК в большинстве клеточных линий с метилированным геном [40]. Некоторыми авторами получены данные, свидетельствующие о связи снижения экспрессии гена RASSF1A с метилированием при скПКР [42], а также в опухолях других локализаций [39, 43]. Частота метилирования изучена с использованием комбинации
3p
VHL
/.NKIRAS1 24.2 (-THRB
iRAR-beta2 23 /TGFBR2
' | AP-20
21.33
21.31
I MECA3 , ILUCA,
21.1
14.2
13
TU3A IFRA3B
4FHIT
MLH1
ITGA9
RBSP3
VILL
DLEC1
GPX1 DAG1 MST1 USP4
RHOA/ARHA MST1R/RON
SEMA3F
SEMA3B
NPRL
HYAL1
HYAL2
FUS1
RASSF1A
CACNA2D2
) UTT1/W91914
Ш
Рис. 1. Критичные районы и кластеры опухоль-ассо-циированных генов 3р.
методов, включая метил-специфичную ПЦР, метил-чувствительный рестриктазный анализ и би-сульфитное секвенирование. Этими методами получены сопоставимые результаты частоты метилирования ЯЛБ8¥1Л при скПКР в интервале от 40 до 50%, причем показано, что эти значения при скПКР существенно выше, чем в опухолях легкого (26%) и молочной железы (31%) [44]. Результатами наших исследований установлено, что метилирование ЯЛБ8¥1Л связано с прогрессией скПКР [45].
Ген БЕЫЛЗВ также отличается разнообразием функций. Имеются данные о том, что белковый
продукт гена SEMA3B может подавлять активацию белков MET и RON, индуцировать апоптоз и подавлять ангиогенез в опухо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.