ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 198-205
УДК 577.152.313:579.222.2:79.252.5
РОЛЬ МИНЕРАЛЬНЫХ ФОСФОРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ПРОЦЕССЕ БИОДЕГРАДАЦИИ НАФТАЛИНА БАКТЕРИЯМИ Pseudomonas putida
© 2015 г. И. Ф. Пунтус, Л. П. Рязанова, А. Н. Звонарёв, Т. В. Фунтикова, Т. В. Кулаковская
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: alla@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Изучено влияние концентрации фосфата в среде культивирования на рост и процесс деградации нафталина Pseudomonas putida BS3701. В среде с глюкозой лимитирование роста бактерии наблюдали при концентрации фосфата 0.1 мМ, а в среде с нафталином — при 0.4 мМ. При недостатке фосфата снижалась активность нафталиндиоксигеназы и салицилатгидроксилазы, а также в среде культивирования накапливался салицилат. При деградации нафталина на среде с фосфатом в клетках P. putida BS3701 накапливалось втрое больше полифосфатов, чем на среде с глюкозой. Полученные данные свидетельствуют о том, что при дефиците фосфата нарушается регуляция экспрессии генов "верхнего" и "нижнего" пути окисления нафталина. Обсуждается участие полифосфатов в регуляции метаболизма нафталина.
Ключевые слова: Pseudomonas putida, фосфат, полифосфаты, нафталин, биодеградация. DOI: 10.7868/S0555109915020154
Неорганические полифосфаты, линейные полимеры ортофосфорной кислоты, являются не только резервными фосфорными соединениями микроорганизмов, но и представляют собой важные регуляторные соединения, вовлеченные в процессы переключения генетических программ и адаптацию к стрессам у бактерий [1—3]. Биодеградация экзогенных соединений требует значительной перестройки метаболизма бактерий, при которой происходит экспрессия большой группы генов. Показано, что при деградации полихлориро-ванного бифенила штамм B4 бактерии Pseudomonas sp. накапливает большие электроноплотные гранулы, состоящие по данным рентгеновского микроанализа в основном из фосфатов [4]. Увеличение содержания полифосфатов было подтверждено и энзиматическим методом. Предполагают, что параллельное увеличение содержания стрессового белка GroEl и реактивных форм кислорода указывает на то, что полифосфаты принимают участие в приспособлении бактерии к потреблению поли-хлорированных бифенилов, которые являются не только источниками углерода, но и химическими стрессовыми факторами [4].
Мутанты P. putida KT2440, лишенные поли-фосфаткиназы, основного фермента, синтезирующего полифосфаты у бактерий, не только отличались пониженным содержанием полифосфатов (до 15% от контрольного), но и были более чувствительны к ультрафиолету, ß-лактамным антибиотикам, Cd2+ и Cu2+ [5]. Р. putida KT2440 содер-
жал плазмиду pWW0 биодеградации толуола, обеспечивающую деградацию т-ксилола. При культивировании на этом субстрате штамм, му-тантный по гену полифосфаткиназы, обладал более длинной лаг-фазой по сравнению с родительским [5].
Эти данные позволяют предположить, что взаимосвязь между обменом полифосфатов и процессами биодеградации чужеродных соединений бактериями обеспечивает адаптацию клеток к усвоению труднодоступных и токсичных источников углерода. В связи с этим целесообразно выявить особенности потребления бактериями фосфата из среды и накопления неорганических полифосфатов в процессе биодеградации подобных соединений.
Цель работы — изучение влияния фосфата в среде культивирования на рост клеток Р. риНйа Б83701 и особенности накопления полифосфатов в процессе биодеградации нафталина.
МЕТОДИКА
В работе использовали штамм Р. риНйа Б83701, способный к деградации полициклических ароматических углеводородов. Штамм получен из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН.
Для культивирования бактерий использовали минеральную среду Эванса (Е), рН 7.0—7.2, следующего состава (мМ): К2НР04 - 50, МН4С1 - 5, №2804 - 0.1, Ы§С12 - 0.062, (мкМ): СаС12 - 1.0 и
(NH4)6Mo7O24 ■ 4H2O - 0.005 [6]. В среду вносили 1.0 мл/л раствора микроэлементов в 1%-ном HCl, следующего состава (г/л): ZnO — 0.41, FeCl2 ■ 6H2O — 5.4, MnCl2 ■ 4H2O — 2.00, CuCl2 ■ 2H2O — 0.17, CoCl2 ■ 6H2O — 0.48 и H3BO3 — 0.06. Среда Эванса с 0.4 мМ и 0.1 мМ K2HPO4 содержала 50 мМ трис-HCl-буфер, рН 7.2. Для получения посевного материала использовали агаризованную среду Е с 50 мМ фосфатом калия и 20 г/л агар-агара ("Pronadisa", Испания). В качестве источника углерода и энергии использовали глюкозу или нафталин (1.0 г/л). При выращивании бактерий на агаризованной среде нафталин вносили на крышку чашки Петри.
О росте культур судили по оптической плотности при 540 нм. Кроме того, определяли количество клеток в культуре с помощью высевов из соответствующих разведений на агаризованную среду LB [7].
Концентрацию салициловой кислоты определяли на спектрофотометре "Sintra 6 UV" (Австралия) как описано в работе [8]. Пробы супернатан-та исследуемых культур (0.5 мл) разводили дистиллированной водой до 3 мл, затем добавляли 0.5 мл 5%-ного раствора Fe(NO3)2 и 0.5 мл 1%-ной HNO3, инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин и измеряли оптическую плотность раствора при 540 нм.
Активность ферментов определяли в бесклеточном экстракте. Клетки культуры, выращенной в среде с нафталином, осаждали центрифугированием на центрифуге K-26D ("Janetzki", Германия) при 5600 g в течение 10 мин при 0°С, дважды промывали 0.05 М калий-фосфатным буфером, рН 7.0, и ресуспендировали в том же буфере. Суспензию клеток замораживали и разрушали на прессе (ИБФМ РАН, Россия). После дезинтеграции клеточный дебрис и не разрушенные клетки удаляли центрифугированием (39000 g, 0°С, 60 мин) на центрифуге "Beckman J2-21" (США). Супернатант немедленно использовали для определения активности ферментов. Для этого в реакционную смесь (конечный объем 3 мл) вносили 100 мкл экстракта. Определение проводили при 30°С на спектрофотометре Ц^160А ("Shimadzu", Япония).
Активность нафталиндиоксигеназы
(КФ 1.14.12.12) определяли по расходованию НАДН, измеряя уменьшение оптической плотности при 340 нм реакционной смеси, содержащей 0.05 М фосфатный буфер, рН 7.5, 100 мкМ НАДН и 100 мкМ нафталина, вносимого в виде спиртового раствора [9].
Активность салицилатгидроксилазы (КФ 1.14.13.1) определяли по уменьшению оптической плотности при 340 нм в реакционной смеси, следующего состава: 0.05 М фосфатный буфер, рН 7.0, 100 мкМ НАДН и 100 мкМ салицилата натрия [10].
Активность катехол-2,3-диоксигеназы
(КФ 1.13.11.2) определяли по скорости образования а-оксимуконового полуальдегида (при 375 нм, s = 33.4 1/мМ см) в реакционной смеси, содержащей: 0.05 М трис-НС1 буфер, рН 7.5, и 0.5 мМ катехола [11].
Активность катехол-1, 2-диоксигеназы
(КФ 1.13.11.1.) оценивали по скорости образования цис-цис-муконата (при 260 нм, s = = 16.9 1/мМ • см) в реакционной смеси, содержащей 50 мМ фосфатный буфер, рН 7.0, 5 мМ ЭДТА-N и 1 мМ катехол [12].
Удельную активность ферментов выражали в микромолях потребленного субстрата или образующегося продукта за 1 мин на1мг белка.
Белок определяли по методу Брэдфорд [13].
Содержание кислоторастворимых и кислотоне-растворимых полифосфатов определяли в клетках P. putida BS3701 в стационарной фазе роста [2]. Биомассу отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 1 ч и промывали 0.85%-ным NaCl. Кислоторастворимую фракцию получали обработкой биомассы 0.5 н HC1O4 при постоянном перемешивании в течение 15 мин при 0°С (на 1.0 г биомассы добавляли 1.0 мл 1.0 н HC1O4 и 9 мл 0.5 н HC1O4). Полученную суспензию центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Экстракцию повторяли дважды и супернатанты объединяли. Количество полифосфатов определяли по содержанию лабильного фосфора, которое рассчитывали по разнице содержания ортофосфата в экстракте до и после гидролиза в 1 н. HCl в течение 10 мин при 100°С [2].
К оставшемуся после экстракции кислотой осадку биомассы добавляли 5—10 мл 0.5 М HC1O4 и нагревали на водяной бане в течение 20 мин при 90°С, периодически перемешивая, а затем центрифугировали в указанном выше режиме. Экстракцию повторяли дважды, супернатанты объединяли. Содержание кислотонерастворимых полифосфатов оценивали по количеству ортофосфата, обнаруживаемого в супернатанте. Ортофосфат определяли согласно [2].
Полифосфаты in vivo определяли окрашиванием флуоресцентным красителем 4',6-диамидино-2-фенилиндол (ДАФИ) ("Sigma", США), который имеет максимум флуоресценции при 456 нм [14]. К 100 мкл суспензии клеток добавляли 5 мкл раствора ДАФИ (1.0 мг/мл). Клетки инкубировали c флуоресцентным красителем в течение 30 мин при 2°С, затем анализировали флуоресценцию с помощью фазово-контрастного люминисцентно-го микроскопа Axio ImagerA1 ("Zeiss", Германия), оборудованного соединенной с компьютером видеокамерой AxioCam MRc "Zeiss" (Германия). В присутствии полифосфатов максимум флуоресценции сдвигался до 525 нм. Комплекс ДАФИ—ДНК флуоресцировал голубым цветом, а
ОП540 1.2
(а)
ОП
540
20 (б)
3
40 ч
120 140 ч
Рис. 1. Влияние концентрации фосфата на рост штамма Р. putida BS3701 в условиях периодического культивирования в жидкой среде Эванса с глюкозой (а) или нафталином (б): 1 — 50 мМ фосфата, 2 — 0.4 мМ фосфата, 3 — 0.1 мМ фосфата.
комплекс ДАФИ—полифосфаты — желтым или оранжевым.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что для ускорения процесса биодеградации гидрофобных соединений применяют фосфорные удобрения [15], однако механизм их стимулирующего действия до сих пор не изучен. В среде Эванса содержится 50 мМ фосфата, который необходим для поддержания нейтрального рН, так как в процессе культивирования бактерий рода Pseudononas в среде накапливаются продукты метаболизма, приводящие к ее закислению [16]. Для определения влияния фосфата на рост P. putida BS3701 было проведено периодическое культивирование в минеральной среде Эванса с глюкозой или нафталином, содержащей различные концентрации фосфата (50, 0.4 и 0.1 мМ). В средах с низким содержанием фосфата для поддержания нейтрального рН использовали 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7.2.
Как видно на рис. 1 потребность P. putida в фосфате для роста зависела от среды
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.