ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2013, том 63, № 4, с. 470-478
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ; ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 581.17
РОЛЬ МИОЗИНОВ В ДЕПРЕССИИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ НЕЙРОНОВ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ К АЦЕТИЛХОЛИНУ НА КЛЕТОЧНОМ
АНАЛОГЕ ПРИВЫКАНИЯ
© 2013 г. А. С. Пивоваров1, Г. Б. Мурзина2, Д. А. Махновский1, Н. А. Васильева1, М. С. Третьякова1
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова", биологический факультет, кафедра высшей нервной деятельности; 2Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, Москва,
e-mail: as_pivovarov@mail.ru Поступила в редакцию 27.12.2012 г.
Принята в печать 11.02.2013 г.
Исследовали вовлечение моторных белков цитоскелета миозинов в молекулярный механизм депрессии чувствительности к ацетилхолину командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Для этого анализировали влияния соединений, нарушающих функции миозинов, — ML-7 и MLCK-IP-18 — блокаторов киназы легких цепей миозина, блеббистатина - ингибитора немышечного миозина II, Y-27632 — ингибитора киназ ROCK-I и ROCK-II (активируют преимущественно немышечный миозин II) на кривую депрессии вызванного ацетилхолином тока нейронов. Обнаружено, что ML-7 и ML-CK-IP-18 ослабляли депрессию тока, а блеббистатин и Y-27632 не изменяли депрессию. Экспериментальные результаты и математическое моделирование эффектов примененных блока-торов на число мембраносвязанных холинорецепторов позволяют предполагать участие миозинов (исключая немышечный миозин II) в эндо- и экзоцитозе холинорецепторов и, вследствие этого, в депрессии холиночувствительности соматической мембраны нейронов на клеточном аналоге привыкания.
Ключевые слова: ML-7, MLCK-IP-18, блеббистатин, Y-27632, депрессия холиночувствительно-сти, командные нейроны, виноградная улитка, привыкание.
Role of Myosins in Depression of Sensitivity of Helix Neurons to Acetylcholine in a Cellular Analog of Habituation
А. S. Pivovarov, G. B. Murzina, D. А. Makhnovsky, N. A. VVasil'yeva, M. S. Tret'yakova
Department of Higher Nervous Activity, Biological Faculty, Moscow Lomonosov State University; Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, Moscow,
e-mail: as_pivovarov@mail.ru
We investigated the involvement of cytoskeleton motor proteins, myosins, in the molecular mechanism of sensitivity depression to acetylcholine in Helix command neurons of defensive behavior in a cellular analog of habituation. There were analyzed the effects of several drugs disturbing myosin function: ML-7 and MLCK-IP-18 — blockers of myosin light chain kinase, blebbistatin — an inhibitor of non-muscle myosin II, Y-27632 — inhibitor of kinases ROCK-I and ROCK-II (activate mainly non-muscle myosin II) on the depression of acetylcholine-induced inward current. It was found that ML-7 and MLCK-IP-18 weakened current depression, blebbistatin and Y-27632 did not change the depression. The results of
experimental inhibitory analysis and mathematical modeling of the effects of inhibitors on the number of membrane-bound cholinergic receptors allow to suggest the involvement of myosins (excluding non-muscle myosin II) in the transports of acetylcholine receptors (endo- and exocytosis) that are responsible for sensitivity changes in neuron somatic membrane to acetylcholine in a cellular analog of habituation.
Keywords: ML-7, MLCK-IP-18, blebbistatin, Y-27632, depression of sensitivity to acetylcholine, command neurons, Helix lucorum, habituation.
DOI: 10.7868/S0044467713040096
По данным литературы, синаптические входы к командным нейронам оборонительного поведения виноградной улитки являются холинергическими [6, 10] и глутаматергиче-скими [12]. Наличие в мембране командных нейронов фармакологически сходных постси-наптических и внесинаптических холиноре-цепторов [6, 8, 10] дает возможность исследовать постсинаптический механизм пластичности командного нейрона в условиях искусственной активации внесинаптических холинорецепторов, позволяющей исключить неконтролируемые изменения выброса медиатора из пресинапса при электрической стимуляции синаптических входов. Локальное подведение к поверхности сомы постоянных по величине порций ацетилхолина (АХ) из инъекционной микропипетки, которая выполняла роль искусственного пресинапса и заменяла пресинаптическую холинергическую терминаль, обеспечивало стабильное раздражение зоны мембраны, содержащей внеси-наптические холинорецепторы. Протокол стимуляции внесинаптических холинорецеп-торов имитировал схему раздражения, вызывавшего привыкание оборонительной реакции животного [5]. Ритмическое подведение АХ в таких условиях приводило к обратимой депрессии вызванного входящего тока (АХ-тока), которая отражала снижение чувствительности мембраны к АХ [5].
Ранее нами было показано, что депрессия холиночувствительности внесинаптических зон мембраны командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания обусловлена снижением числа мембранных холино-рецепторов в зоне тестирования [4]. Транспортные процессы (эндоцитоз и экзоцитоз, лежащие в основе интернализации и рециклирования рецепторов соответственно) обеспечивают эти изменения на соматической мембране нейронов с участием элементов цитоскелета — актиновых микрофиламентов и микротрубочек [4, 7]. Особая группа мотор-
ных белков, или, как их еще называют, "молекулярных моторов", взаимодействуют с микротрубочками и актиновыми филамента-ми в процессе транспорта везикул. Известны три семейства моторных белков: 1) кинезины и 2) динеины, которые передвигаются вдоль микротрубочек, а также 3) миозины, которые перемещаются вдоль актиновых микрофиламентов.
В настоящее время выделяют до 24 классов миозинов [28], из которых 8 классов (I, II, III, V, VI, VII, IX и XV) присутствуют в нервных и сенсорных клетках [13, 16, 27]. В везикулярном транспорте принимают участие миозины V и VI. Миозин V участвует в экзоцитозе, а миозин VI — в эндоцитозе [20, 21]. Хотя миозин II и может быть везикулярным мотором, но пока его участие в везикулярном транспорте не установлено [16]. Имеется предположение, что рецепторный транспорт с участием актиновых микрофиламентов возможен и без миозинов, за счет образования на плюс-конце актиновой нити кометоподоб-ного хвоста [2, 11].
Детализация молекулярного механизма депрессии холиночувствительности командных нейронов виноградной улитки, учитывая заключение об участии актиновых микрофиламентов, объясняет необходимость исследования роли миозинов в механизме депрессии. Поэтому целью настоящей работы было исследование участия миозинов, в частности немышечного миозина II, в молекулярном механизме изменения холиночувствительно-сти командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Работа включает две части: экспериментальную (ингибиторный анализ в электрофизиологических экспериментах) и теоретическую (математическое моделирование различного расположения ацетилхолиновых рецепторов в нейроне и их транспорта, который объяснял развитие и поддержание депрессии холиночувствитель-ности сомы в экспериментах).
МЕТОДИКА
Электрофизиологические эксперименты проведены на идентифицированных нейронах ЛПа3, ЛПа2, ППа3 и ППа2 [1] виноградной улитки Helix lucorum (улитки собраны в Крыму, в окрестностях г. Севастополя) на препарате изолированных ганглиев. Указанные нейроны вовлечены в реализацию оборонительного поведения этого наземного моллюска [3].
Препарат изолированных ганглиев. Предварительно животное анестезировали, охлаждая в течение 30 мин в смеси воды со льдом. Затем из тела улитки извлекали нервное окологлоточное кольцо ганглиев, которое фиксировали стальными микроиглами в проточной камере к подложке, изготовленной из полимерного материала силгард (Dow-Corning). Объем камеры составлял 1 мл, она была заполнена физиологическим раствором (мМ): NaCl - 100; KCl - 4; CaCl2 - 10; MgCl2 -4; трис-HCl - 10; pH 7.5-7.7. После обработки нервного окологлоточного кольца ганглиев ферментом - раствором дигестазы ("Seatec", Россия-Люксембург; 8 мг/1.2 мл, 20-70 мин при комнатной температуре), удаляли соединительнотканные оболочки, покрывающие ганглии.
Регистрация трансмембранных ионных токов. Для регистрации трансмембранных токов нейронов использовали методику двух-электр одной фиксации потенциала на мембране по схеме заземления объекта на "виртуальную землю". Для этого применяли микроэлектродный усилитель MEZ-8201 и усилитель фиксации потенциала CEZ-1100 (оба прибора фирмы "Nihon Kohden", Япония). Внутриклеточные электроды для двух-электродной фиксации потенциала, изготовленные из стекла "пирекс" ("Harvard Apparatus", США), заполняли 2 М ацетатом калия. Сопротивление электродов 4-44 МОм (19.48 ± ± 1.02 МОм; среднее арифметическое ±SEM). Регистрируемые токи подавали через аналого-цифровой интерфейс L-154 (АО "L-CARD", Россия) на персональный компьютер и с помощью программы CONAN 3.0 записывали на жесткий диск, а после эксперимента анализировали изменение амплитуд токов. В эксперименте токи записывали также на чернильном самописце КСП-4 для оценки их динамики в реальном времени.
Тестирующая стимуляция. Применяли локальную ионофоретическую аппликацию АХ на дорзальную поверхность сомы нейрона из
стеклянной микропипетки, заполненной 1 М хлоридом АХ ("Sigma", США). Сопротивление форетических пипеток составляло 10—45 МОм. Индифферентная пипетка в цепи микроио-нофореза была заполнена физиологическим раствором (сопротивление 1—5 МОм). В цепь ионофореза было последовательно подключено ограничивающее сопротивление 100 МОм. Катионные токи (200—500 нА, 0.3—3.0 с) пропускали через пипетку с раствором АХ от изолирующего от земли устройства, подключенного к выходу электростимулятора ЭСЛ-2. Для оценки величины входного сопротивления нейрона измеряли амплитуду тока утечки, вызванного гиперполяризующим смещен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.