СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2009, том 23, № 1, с. 67-71
ОБОНЯТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА
УДК 612.86
РОЛЬ ОСНОВНОЙ И ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В ДЕТЕКЦИИ ФЕРОМОНА МЛЕКОПИТАЮЩИХ АНДРОСТЕНОНА У ДОМОВОЙ МЫШИ
© 2009 г. В. В. Вознесенская, М. А. Ключникова
Институт проблем экологии и эволюции им. АН. Северцова РАН 119071 Москва, Ленинский проспект, 33 E-mail: vvoznessenskaya@gmail.com Поступила в редакцию 19.05.2008 г.
В настоящей работе мы исследовали роль основной обонятельной системы и вомероназального органа в детекции андростенона. Были использованы следующие основные подходы: поведенческий и иммуногистохимический. Эффективность удаления вомероназального органа контролировалась иммуногистохимически. Хирургическое удаление вомероназального органа вызывало падение чувствительности к андростенону у мышей линии CBA (n = 20) в 4-16 раз (p < 0.01), но не влияло на чувствительность к андростенону у мышей линии NZB (n = 20), предварительно сенситизированных к этому одоранту. Полученные данные указывают на вовлечение как основной обонятельной системы, так и вомероназального органа в детекцию анростенона у мышей. Мы наблюдали специфический паттерн Fos-позитивных клеток в медиовентральной части основной обонятельной луковицы мышей линии CBA (n = 6), но не NZB (n = 6) в ответ на стимуляцию 0.1% андростеноном. Стимуляция андростеноном вызывала активацию в дополнительной обонятельной луковице у обеих линий мышей. Аналогично в рецепторном эпителии вомероназального органа в ответ на стимуляцию андростеноном наблюдали Fos-позитивные клетки у мышей обеих линий. У высокочувствительных к одоранту мышей линии CBA мы наблюдали активацию как в апикальной, так и в базальной зоне. У мышей линии NZB отмечена активация только в апикальной зоне рецепторного эпителия воме-роназального органа.
Ключевые слова: феромон, вомероназальный орган, хеморецепторы, ольфакторное поведение, им-муногистохимия.
ВВЕДЕНИЕ
Андростенон (5a-androst-16-en-3-one) является летучим стероидом гонадного происхождения, который присутствует в значительных количествах в слюне хряка. У рецептивных самок свиней андростенон вызывает принятие позы лордоза (Reed et al., 1974). В литературе андростенон чаще упоминается как половой феромон хряка. У других видов млекопитающих, в том числе и у человека, андростенон содержится в слюне, моче, а также и в выделениях потовых и сальных желез как у мужских, так и у женских особей. У особей мужского пола содержание этого одоронта в выделениях и секретах желез значительно превышает таковое у женских (Brooksbank et al., 1974; Bird, Gower, 1983; Claus, Asling, 1976). Андростенон также обнаружен и в растительных продуктах, например, в трюфелях и сельдерее. В современной литературе достаточно активно обсуждается возможное межвидовое действие этого стероида. Ряд публикаций указывает на тот факт, что андростенон может оказывать влияние на сексуальное поведение человека (Cowley et al.,
1977; Kirk-Smith et al., 1978; Benton, 1982; Van Toller et al., 1983; Filsinger et al., 1984). Однако следует отметить, что результаты исследований этих авторов достаточно противоречивы и носят скорее предположительный характер. Более поздними исследованиями показана инициация агрессивного поведения субсенсорными дозами андростенона у болельщиков на стадионах при проведении футбольных матчей (Pause, 2004). Отдельные публикации указывают на возможную роль андростенона в инициации актов агрессивного поведения у мышей. Например, Ингерсол и Лауни (Ingersoll, Launay, 1986) показали, что в определенном контексте агрессия у мышей может быть индуцирована андростеноном. Андростенон - один из немногих феромонов млекопитающих, для которого установлена точная химическая структура и описан весь спектр классических феромональных эффектов, что позволяет использовать его в качестве модельного феромона.
Обонятельная система грызунов состоит из двух основных отделов: основной обонятельной системы (ООС) и дополнительной обонятельной
67
5*
системы (ДОС). Дополнительная обонятельная система (или вомероназальная) сформировалась как более специализированная для детекции феромонов (Wyatt, 2004). Принимая во внимание возможную роль андростенона в феромональной регуляции агрессивного поведения у домовой мыши, в работе была поставлена задача - исследовать роль вомероназальной системы в детекции феромона млекопитающих андростенона у домовой мыши.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования использовали мышей инбредных линий CBA/J (СВА) и NZB/B1NJ (NZB). Ранее нами на основе этих инбредных линий была разработана генетическая модель специфической аносмии к андростенону (Voznessenskaya, Wysocki, 1994; Voznessenskaya et al., 1994). Животных содержали в стандартных условиях вивария. Мы использовали световой режим: 12 ч света, 12 ч без освещения; температура варьировала от 20 до 22°С. Сбалансированный комбикорм, зерно, вода были в свободном доступе.
Пороги чувствительности к андростенону определяли на основе условного рефлекса c положительным подкреплением в F-образном лабиринте (Beauchamp et al., 1985). В качестве подкрепления использовали слегка подслащенную воду. В первой серии экспериментов животных обучали отличать рукав лабиринта, содержащий образец одоранта, от рукава лабиринта, где помещали очищенный растворитель (легкое минеральное масло, Sigma). Положение (левый, правый рукав) подкрепляемого одоранта чередовали в случайном порядке. Мы использовали следующие одоранты: амилацетат (запах банана), фени-лэтиловый спирт (запах розы), галаксолид (мускусный запах), 80% правильных решений были приняты в качестве условного критерия обучен-ности. По достижении критерия обученности все животные протестированы на способность различать андростенон. После чего на протяжении двух-трех дней были определены пороги чувствительности при понижающейся концентрации андростенона. Использовали бинарные разбавления от исходной концентрации 0.1% (концентрация насыщенных паров), т.е. каждый следующий порог был в 2 раза ниже предыдущего.
Удаление вомероназального органа проводили по методике, разработанной Вайсоки (Wysocki, Wysocki, 1995). Эффективность удаления вомероназального органа контролировали при помощи иммуногистохимических методов (лектиниммуно-гистохимия) по степени деградации гломерул в дополнительной обонятельной луковице (Wysocki, Wysocki, 1995). По завершении экспериментов животных перфузировали 3%-ным раствором формалина. Срезы через обонятельные лукови-
цы толщиной 40 мкм приготовлены при помощи замораживающего микротома Triangle Biomedical (Fisher Scientific). Срезы окрашены по стандартному протоколу (Wysocki, Wysocki, 1995).
Для индукции чувствительности к андростенону у нечувствительных мышей линии NZB мы использовали экспозиции этого одоранта на протяжении двух недель в режиме: 16 ч - экспозиция одоранта, 8 ч - подача очищенного воздуха (Voznessenskaya et al., 1994). Экспозиции проводили в климатической камере с изолированными отсеками, индивидуальной подачей и отводом очищенного воздуха для каждого отсека (ASP130, Flur France).
Для стимуляции нейрональной активности в ре-цепторной ткани вомероназального органа продолжительность экспозиции андростенона (0.1%) составляла 90 мин (Voznessenskaya et al., 2007). Оптимальное время экспозиции установлено эмпирически. После окончания экспозиции к андростенону животным вводили внутрибрюшинно нембутал в дозе 40 мг/кг. Животных перфузировали через сердце по стандартной методике с использованием 3%-ного раствора формалина. Во-мероназальный орган удаляли целиком в хрящевой капсуле через ротовую полость. Капсулу помещали на 16 ч в 3%-ный раствор формалина. В качестве криопротектора использовали сахарозу возрастающей концентрации: 10%-ный раствор (24 ч), 20%-ный раствор (24 ч), 30%-ный раствор (24 ч). Вомероназальный орган в хрящевой капсуле подвергали быстрой заморозке в крио-стате при -40°С. Срезы толщиной 18 мкм были приготовлены в криостате Triangle Biomedical (Fisher Scientific, США) при температуре -15°С.
Иммуногистохимическое окрашивание срезов вомероназального органа проводили по стандартному протоколу, с использованием поликлональ-ных первичных антител к белку Fos (Santa Cruz Biotechnology, США). Вторичные биотинилиро-ванные антитела и готовые растворы для приготовления комплекса пероксидаза хрена-биотин-авидин (АВС© Elite kit) были получены от фирмы Vector© (США). Визуализировали связывание антител при помощи красителя диаминобензидина (Sigma). Регистрация паттернов активации и подсчет Fos-позитивных клеток осуществляли при помощи микроскопа Nikon с цифровой камерой, снабженной программным обеспечением ImageJ.
Для стимуляции нейрональной активности в основной обонятельной и дополнительной обонятельной луковице был использован аналогичный протокол. При этом продолжительность стимуляции составляла 40 мин и носила прерывистый характер: 30 с - струя чистого воздуха; 30 с - 0.1% андростенон. Толщина срезов обонятельных луковиц составляла 20 мкм.
РОЛЬ основной и дополнительной обонятельной системы
69
■
Самки (n = 10) Самцы (n = 10)
NZB
Самки (n = 10)
CBA
Сямцы (n = 10)
5 10 15 20
Пороги чувствительности (бинарные разведения 0.1% андростенона)
Рис. 1. Пороги чувствительности к андростенону у мышей инбредных линий СБА/Т и К2Б/Б1Ш.
>. и f к
и
и
О &
О
С
12 10 8 6 4 2 к0 -2 -4
До удаления BHO После удаления BHO
NZB/B1NJ
У////////Л
CBA/J
Рис. 2. Влияние удаления вомероназального органа на пороги чувствительности к андростенону у мышей инбредных линий.
0
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пороги чувствительности к андростенону у мышей линии СВА, определенные на основе условно-рефлекторной питьевой побежки с положительным подкреплением, составляли 10-5—5 х 10-5%. Удаление вомероназального органа приводило к снижению чувствительности к андростенону у мышей этой линии в 4-16 раз (п = 20). Таким образом, мыши линии СВА с удаленным вомерона-зальным органом детектировали андростенон в концентрации 1.25 х 10-5-1.6 х 10-4%. Поскольку мыши линии К2Б практически не чувствительны к андростенону, то перед операцией удаления вомероназа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.