УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2007, том 127, № 1, с. 50-57
УДК 577.3:577.121.7
РОЛЬ ПАРАМЕТРОВ СИСТЕМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ТОКСИГЕНИЗАЦИИ СРЕДЫ УСЛОВНО-ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ
© 2007 г. Л. Н. Шишкина1, В. А. Меньшов1, О. Г. Шубина2, Е. В. Идрисова3, Н. В. Слуянова2,
И. И. Самойленко3
1Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2Московский государственный университет пищевых производств, Москва 3Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
Обобщены результаты исследований роли параметров физико-химической системы регуляции пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) в токсигенизации среды после роста пяти штаммов условно-патогенных грамотрицательных бактерий. Установлено, что закономерные изменения антиокси-дантных свойств и состава липидов сред в зависимости от степени их токсичности свидетельствуют о функционировании физико-химической системы регуляции ПОЛ "бактерии - среда культивирования" как единого целого, оказывая влияние на метаболизм микробной клетки.
ВВЕДЕНИЕ
Основное внимание микробиологов преимущественно направлено на изучение роли ферментативных процессов в жизнедеятельности микроорганизмов [4, 10, 20, 24, 26, 28, 37, 58]. Однако регуляция метаболизма, осуществляемая при активном участии процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), тесно взаимосвязана с функционированием системы клеточных мембран [38, 42, 59, 60, 64], одними из важных компонентов которых и в клетках большинства микроорганизмов являются фосфолипиды (ФЛ) [41, 42]. Выявлена взаимосвязь между наличием природных антиокси-дантов (АО) в среде культивирования и составом ФЛ дрожжей [22]. Установлено участие ФЛ в фагоцитозе и транслокации белков через плазматическую мембрану микробных клеток [9, 40, 43, 55, 62]. Однако взаимодействие клеток микроорганизмов с окружающей средой не ограничивается только секрецией клетками протеолитических ферментов или влиянием состава среды культивирования на жирнокислотный состав липидов и соотношение фракций в ФЛ микроорганизмов. Различные виды микроорганизмов способны выделять в окружающее пространство жирные кислоты, свободные радикалы, пероксиды [1, 2, 25, 29]. Диффузии малых гидрофильных молекул через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий способствуют порины, образующие водные каналы [39]. Обмен ФЛ между бактериальной клеткой и средой может являться как показателем метаболической активности клеток [44], так и следствием повреждения внешней мембраны [56].
Внеклеточные протеазы бактерий участвуют в инфекционном процессе, активируя синтезируе-
мые ими токсины [24]. Однако для проявления эффекта токсичности различными штаммами бактерий необходимы определенные условия. Это вызвало появление понятия "условно-патогенная микрофлора" (УПМ). Наиболее часто эндогенные инфекционные очаги и септические состояния в организме человека обусловлены грамотрица-тельными энтеробактериями, среди которых E. coli, Klebsiella, Proteus [3]. Согласно одной из точек зрения, многообразие патологических эффектов бактериальных эндотоксинов в организме обусловлено действием нескольких десятков медиаторов, высвобождающихся из клеточных и гуморальных источников [33]. Отсутствие в ряде случаев количественного соответствия между содержанием бактериального токсина и степенью токсического действия на биологическую тест-систему [11, 12], наличие среди медиаторов эндотоксинов гиста-мина и серотонина [33], обладающих антиокси-дантными (АО) свойствами [8], с одной стороны, а также свободных радикалов и продуктов сво-боднорадикального окисления [33], с другой, позволяют предположить участие процессов ПОЛ в токсигенизации среды УПМ.
Целью данного обзора является обоснование роли параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ в токсигенизации среды культивирования условно-патогенными грамотрица-тельными бактериями.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы бактерии Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris и Citrobacter freundii, поскольку показано, что они являются этиологическим фак-
Таблица 1. Количество пероксидов и антипероксидная активность липидов арахисовых питательных сред после роста различных бактериальных культур
Бактериальная культура Токсичность, баллы [ROOH]0, ммоль/г.глипидов АПА, ммоль/г.глипидов
Исходная среда 0 0.36 ± 0.245 (n* = 9)
C. freundii 1922 0 2.55 ± 2.05 (n = 3)
C. freundii 1922 2 0.30 (n = 1)
C. freundii 1922 3 0.42 (n = 1) 0.45 (n = 1)
C. freundii 1922 4 0.63 ± 0.42 (n = 4) 0.54 ± 0.23 (n = 3)
K.pneumonia 195 2 0.07 (n = 1) 0.76 (n = 1)
K. pneumonia 99 3 3.75 ± 3.0 (n = 2)
P. aeruginosa 102 4 0.48 (n =1)
E. coli 50 0.5 0.06 ± 0.03 (n = 2) 0.87 ± 0.86 (n = 2)
E. coli 4 3 3.4 ± 3.3 (n = 3)
E. coli 11 4 0.05 ± 0.03 (n = 2) 0.17 (n = 1)
* Количество параллельных экспериментов.
тором желудочно-кишечных заболеваний человека и животных, возникающих в результате потребления пищевых продуктов и кормов, контаминиро-ванных этими бактериями [15, 31, 32]. Штаммы E. coli, P. aeruginosa, K. pneumonia и C. freundii взяты из коллекции Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, штамм P. vulgaris - из коллекции кафедры "Биотехнология микробного синтеза" МГУПП. Номера штаммов указаны в табл. 1-5.
Культивирование бактерий осуществляли на качалке при 37°С в течение 48 ч в арахисовой питательной среде (АПС). Методика приготовления АПС подробно описана в [19]. Отделение микробных клеток проводили центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин с последующим фильтрованием супернатанта через фильтры (Сынпор и Millipore) с диаметром пор 0.6 мкм. Затем среды лиофильно высушивали. Липиды из среды выделяли по методу Блая и Дайера в модификации Кейтса [16]. Величину антиокислительной активности (АОА) липидов определяли на метилолеатной окислительной модели при температуре окисления 37.0 ± 0.1°С [7].
Качественный и количественный состав фос-фолипидов (ФЛ) анализировали методом ТСХ на силикагеле типа G или H, используя системы растворителей хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода в соотношениях 50 : 30: 8 : 4 или 60 : 50 : 1 : 4 [5]. Проявление хроматограмм проводили в парах йода. О количестве неорганического фосфата после перенесения пятен с пластинки и сжигания с хлорной кислотой судили по интенсивности образования фосфорномолибде-нового комплекса в присутствии аскорбиновой кислоты спектрофотометрически при 810 нм на спектрофотометре Du-50 (фирма "Beckman",
США). Для построения калибровочных прямых использовали калий фосфорнокислый однозамещен-ный марки "ос.ч." Оценивали также обобщенные показатели состава липидов: содержание ФЛ в составе общих липидов (% ФЛ); отношение фосфати-дилхолин/фосфатидилэтаноламин (ФХ/ФЭ); соотношение сумм более легко- (ЛО) и более трудно-
Таблица 2. Антиокислительная активность липидов АПС и сред культивирования после роста разных штаммов грамотрицательных бактерий
Бактериальная АОА липидов, Токсич-
культура ч мл/г ность, баллы
Исходная АПС 3700 ± 1150 (n* = 3) 0
Klebsiella 6470 (n = 1) 2
pneumonia 195
Klebsiella 9200 (n = 1) 3
pneumonia 99
Pseudomonas >5500 (n = 1) 4
aeruginosa 102
Escherichia coli 50 4620 ± 1100 (n = 3) 0.5
Escherichia coli 4 19600 (n = 1) 3
Escherichia coli 11 7000 (n = 1) 4
Исходная АПС 14000 ± 360(n = 2) 0
Citrobacter 6200 (n = 1) 0
freundii 1922
Citrobacter >9600 (n = 1) 2
freundii 1922
Citrobacter 28850 (n = 1) 3
freundii 1922
Citrobacter 32600 ± 750(n = 3) 4
freundii 1922
* Количество параллельных экспериментов.
Таблица 3. Состав фосфолипидов АПС и сред после роста штаммов P. aeruginosa 102 и Klebsiella pneumonia
Фракция ФЛ, Показатель P. aeruginosa, n* = 3 K. pneumonia Исходная АПС (n = 14)
195 (1), n = 6 99 (2), n = 3
ЛФХ 3.87 ± 0.42 1.61 ± 0.12 3.72 ± 0.16 1.80 ± 0.60
СМ 4.35 ± 1.05 4.88 ± 0.21 5.95 ± 2.40
ФХ 7.35 ± 0.80 9.50 ± 0.75 5.34 ± 0.23 30.35 ± 4.10
ФИ + ФС 11.25 ± 1.25 7.75 ± 0.60 12.30 ± 0.55 19.9 ± 3.30
ФЭ 38.60 ± 4.10 45.05 ± 6.45 48.05 ± 3.75 11.85 ± 3.75
ФГ + КЛ + ФК 38.95 ± 6.55 31.75 ± 6.65 25.70 ± 2.65 30.15 ± 4.80
% ФЛ в составе ОЛ 3.40 ± 0.25 2.95 ± 0.60 2.04 ± 0.14 3.40 ± 0.95
Примечание. Токсичность: P. aeruginosa - 4 балла, Klebsiella pneumonia 195(1) - 2 балла, 99(2) - 3 балла. Звездочкой отмечено количество параллельных измерений.
Таблица 4. Состав фосфолипидов АПС и сред после роста штаммов Escherichia coli
Фракция, Исходная АПС Escherichia. coli
Показатель 4) 1 1 * (n 50 (n = 4) 4 (n = 5) 11 (n = 10)
ЛФХ 1.80 ± 0.60 4.50 ± 0.90 2.05 ± 1.20 4.40 ± 1.45
СМ 5.95 ± 2.40 7.60 ± 4.65
ФХ 30.35 ± 4.10 26.68 ± 0.33 4.15 ± 1.70 8.35 ± 2.50
ФИ + ФС 19.9 ± 3.30 7.0 ± 2.35 21.65 ± 2.35 9.35 ± 2.95
ФЭ 11.85 ± 3.75 22.15 ± 0.85 42.95 ± 2.55 54.5 ± 3.05
ФГ + КЛ + ФК 30.15 ± 4.80 39.65 ± 1.15 21.65 ± 3.30 23.45 ± 3.15
% ФЛ в составе ОЛ 3.40 ± 0.95 2.05 ± 0.55 7.35 ± 2.40 3.25 ± 0.45
Примечание. Токсичность: Escherichia coli 50 - 0.5 балла, 4 - 3 балла, 11 - 4 балла. Звездочкой отмечено количество парал-
лельных измерений.
Таблица 5. Состав фосфолипидов АПС и сред после роста Citrobacter freundii 1922
Фракция, Исходная АПС Citrobacter freundii 1922
показатель (n* = 4) (1) (n = 2) (2) (n = 16) (3) (n = 7)
ЛФХ 10.35 ± 0.80 6.32 ± 0.43 4.22 ± 0.50 5.74 ± 0.48
СМ 4.43 ± 0.36 16.6 ± 1.15 3.05 ± 0.40 7.85 ± 1.75
ФХ 31.6 ± 3.80 18.54 ± 0.26 7.50 ± 1.30 21.30 ± 2.95
ФС + ФИ 14.2 ± 1.20 31.34 ± 0.21 15.65 ± 2.25 17.05 ± 1.50
ФЭ 14.95 ± 1.20 14.65 ± 0.12 22.8 ± 2.45 27.25 ± 4.0
ФГ 6.85 ± 1.90 17.40 ± 0.82 4.50 ± 0.90
КЛ + ФК 17.65 ± 3.15 12.60 ± 1.50 29.35 ± 1.40 16.35 ± 1.10
% ФЛ в составе ОЛ 8.25 ± 1.55 13.60 ± 0.55 6.55 ± 0.55 5.80 ± 0.90
Примечание. Токсичность Citrobacter freundii 1922: 1 - 2 балла, 2 - 3 балла, 3 - 4 балла. Звездочкой отмечено количество параллельных измерений.
окисляемых (ТО) фракций ФЛ (ИЛОФЛ/ЕТОФЛ). Последнее вычисляли по формуле:
ИЛОФЛ/ГГОФЛ = (ФИ + ФС + ФЭ + ФГ + КЛ + + ФК)/(ЛФХ + ФХ + СМ),
где ФИ - фосфатидилинозит, ФС - фосфатидил-серин, ФГ - фосфатидилглицерин, Кл - ка
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.