БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 4, с. 322-328
УДК 577.152.1
РОЛЬ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП
© 2013 г. Т. М. Горбачева*, М. Ю. Сыромятников, В. Н. Попов, А. В. Лопатин, А. Т. Епринцев, Д. Н. Федорин
Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1; *электронный адрес: soki-tanya@yandex.ru Поступила в редакцию 30.06.2012 г. После доработки 13.03.2013 г.
Изучено влияние пероксида водорода на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [КФ 1.3.5.1] — мембраносвязанного фермента цикла Кребса, компонента второго комплекса электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), у представителей разных таксономических групп, отличающихся интенсивностью окислительного метаболизма: крыс Rattus norvegicus (печень), шмелей Bombus terrestris (летательные мышцы), картофеля Solanum tuberosum (клубни) и кукурузы Zea mays (проростки). Проведено сравнительное изучение действия пероксида водорода на активность СДГ в суспензии митохондрий исследуемых объектов. Для исключения влияния примесей получены электрофоретически гомогенные препараты СДГ. Показано, что препарат СДГ из летательных мышц шмеля гораздо более устойчив к действию высоких концентраций пероксида водорода, тогда как фермент растений наиболее чувствителен к инактивирующему действию Н2О2. Обсуждается возможный механизм влияния активных форм кислорода на мембраносвязанную и растворимую формы СДГ из разных организмов.
Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, активные формы кислорода (АФК), пероксид водорода.
Б01: 10.7868/80233475513040038
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) катализирует реакцию окисления сукцината в цикле Кребса, являясь одновременно ферментом цикла Кребса и компонентом второго комплекса дыхательной цепи митохондрий [1, 2]. В отличие от других компонентов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) этот комплекс и, в частности, каталитическая РАЭ-со-держащая субъединица А обладают высокой консервативностью у эволюционно отдаленных организмов [3]. Установлено, что основными участками образования активных форм кислорода (АФК), т.е. утечки электронов в ЭТЦ митохондрий, являются комплекс I — МАЭРН-дегидроге-наза, комплекс III — убихинол-цитохром-с-окси-доредуктаза и митохондриальная глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа [4— 6]. Совсем недавно обнаружили, что комплекс II ЭТЦ — сукцинат-уби-хинон-редуктаза (СУР), также генерирует АФК в прямом и обратном направлениях [7].
Повреждение клеток под действием АФК уже давно вызывает повышенный интерес. Показано, что митохондрии могут быть не только источником свободных радикалов, но и мишенью их действия [8, 9]. Первичным продуктом неполного восстановления кислорода является 02-, кото-
рый нейтрализуется митохондриальной Мп-со-держащей супероксиддисмутазой (СОД) с образованием Н202. Известно, что пероксид водорода — это наиболее стабильная молекула из всех АФК. Пероксид водорода обладает относительно большим временем жизни, хорошо растворяется в воде и благодаря отсутствию заряда легко проникает через биологические мембраны, тогда как гид-роксильный радикал и супероксидный анион-радикал плохо проходят сквозь мембраны [10]. Более того, все больше данных свидетельствует о том, что АФК могут выступать в роли сигнальных молекул [11]. Известно, что Н202 может выступать как фактор, регулирующий активность ферментов. Большая группа ферментов не чувствительна к Н202 в физиологических концентрациях [12, 13]. В то же время ряд белков, содержащих ре-докс-чувствительные простетические группы или тиольные группы в активных центрах, характеризуются высокой чувствительностью даже к низким концентрациям Н202 [14]. Так, в условиях ги-поксии-реоксигенации в суспензии митохондрий и в культуре клеток наблюдалось подавление активности СДГ [15]. Есть данные и о том, что АФК, продуцируемые системой ксантин-ксантинокси-
даза, также могут проникать в изолированные митохондрии и повреждать клеточные структуры [16]. Изучена также устойчивость ферментов цикла Кребса в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в клетках нервной ткани [17]. Изучение особенностей функционирования и регуляции СДГ представляет значительный интерес, поскольку обнаружено, что нарушения структуры фермента и экспрессии генов, кодирующих отдельные его субъединицы, сопряжены, в частности, с развитием канцерогенеза [18—20].
Представляется важным понимание механизмов окислительного повреждения ферментных систем клетки, в частности компонентов мембран митохондрий организмов, принадлежащих к различным таксономическим группам. Так, насекомые, в частности земляные шмели ВотЪин 1ег-гез1ш (Ь.), могут использоваться в качестве модельного объекта для изучения окислительного стресса, так как они отличаются интенсивным дыхательным метаболизмом, что определяется высокими затратами энергии во время полета [21, 22]. Интенсификация энергетического метаболизма, повышение скорости работы ЭТЦ и, как следствие, высокий уровень образования АФК обусловливают важность изучения биохимических процессов, протекающих в митохондриях. Как известно, 2—5% потребляемого кислорода идет на образование АФК [23]. При усиленном поступлении кислорода в клетки или нарушении работы ЭТЦ митохондрий образование АФК может значительно возрастать [8]. Целью данной работы было сравнение чувствительности СДГ представителей разных таксономических групп: растений (картофель, кукуруза), насекомых (шмели) и млекопитающих (крысы) к воздействию Н202. Наличие Бе^-кластеров в структуре фермента делает потенциально возможным участие АФК в регуляции активности СДГ по аналогии с аконитатгидратазой. Полученные данные дополняют представления о работе сукцинатде-гидрогеназной системы и эволюции этого фермента.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили земляной шмель (B. terrestris), крысы (R. norvegicus), картофель (S. tuberosum) и кукуруза (Z. mays).
Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования [24]. Тораксы измельчали ножницами и гомогенезировали в среде выделения следующего состава: 220 мМ манни-тол, 100 мМ сахароза, 1 мМ EGTA, 2 мг/мл БСА (свободный от жирных кислот), 20 мМ HEPES pH 7.3 в соотношении 1 : 7. Все процедуры проводили при температуре не выше 4°С.
Активность СДГ измеряли спектрофотомет-рически на СФ-2000 (ЛОМО, Россия) при длине волны 600 нм. Для этого использовали метод, основанный на применении искусственных акцепторов электронов [25]. Активность СДГ определяли в среде, состоящей из 0.1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7.8), содержащего 50 мМ сукцината натрия, 3 мМ феназинметасульфата (ФМС), 0.002% дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ), 5 мМ NaN3. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, восстанавливающего 1 мкМ ДХФИФ за 1 мин при 25°С. Общее количество белка определяли по методу Лоури [26].
Фермент очищали с использованием модифицированной четырехстадийной схемы [27]: 1) гомогенизация и выделение митоходрий. Осадок, содержащий в основном митохондрии и микротельца, ресуспендировали в 1 мл среды (0.1 М натрий-фосфатный буфер (рН 7.8), 0.01% тритон Х-100 (конечная концентрация в 1 мл), 20 мМ сукцинат натрия); 2) фракционирование сульфатом аммония; 3) обессоливание препарата белка при помощи гель-фильтрации на колонке с сефа-дексом G-25 (1.7 х 15 см) (Pharmacia, Швеция), уравновешенной 0.1 М натрий-фосфатным буфером (рН 7.8); 4) ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl (1.8 х 20 см) (Toyosoda, Япония), элюцию осуществляли линейным градиентом KCl.
Электрофорез проводили в 12.5% полиакрила-мидном геле в присутствии додецилсульфата Na (ДДС-ПААГ) по методике Лэммли [28]. Для построения калибровочной кривой использовали стандартные маркерные белки (Sigma, США) (кДа): целлюлаза — 94.6, бычий сывороточный альбумин — 66.2, карбоангидраза — 31.0, ингибитор трипсина — 21.5. Каждый образец содержал 3—5 мкг белка.
Электрофорез нативных белков проводили в 8% ПААГ по модифицированному методу Дэвиса [29]. Растворы готовили согласно [30].
Белки окрашивали нитратом серебра [31]. С целью специфического проявления (тетразолие-вый метод) пластинку геля помещали в среду следующего состава: 0.1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7.5), 0.1 М сукцинат, 0.5 мг/мл нитроси-ний тетразолий, 1 мг/мл ФМС [24]. Гели хранили в 7% растворе уксусной кислоты.
Для изучения влияния пероксида водорода на активность СДГ в суспензии митохондрий в кюветы со средой и митохондриями последовательно вносили Н2О2 в концентрации от 1 мкМ до 10 мМ и инкубировали в течение 10 мин, после чего измеряли активность фермента. При работе с электро-форетически гомогенными препаратами СДГ в кюветы со средой и препаратом СДГ вносили Н2О2 в тех же концентрациях, инкубировали в течение 10 мин и измеряли активность фермента.
Очистка сукцинатдегидрогеназы из разных организмов
Объект Объем пробы, мл Содержание белка, мг Общая активность, Е Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки, разы
Проростки кукурузы 8 0.12 ± 0.006 0.74 ± 0.04 6.44 ± 0.32 12.85 105.49
Клубни картофеля 5 0.07 ± 0.004 0.35 ± 0.02 5.00 ± 0.25 16.05 166.67
Печень крысы 12 0.05 ± 0.003 0.50 ± 0.02 10.33 ± 0.52 6.14 73.80
Летательные мышцы 2 1.1 ± 0.001 0.15 ± 0.01 7.14 ± 0.32 21.24 81.55
шмелей
Все опыты проводили в трехкратной повтор-ности. В таблице и на графиках представлены средние арифметические значений и стандартные ошибки их определения [32, 33].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показано, что под действием Н2О2 снижается активность СДГ в суспензии митохондрий из так-сономически удаленных организмов. Уровень ингибирования активности фермента варьировал в зависимости от объекта (митохондрии из печени крыс, летательных мышц насекомых, клубней картофеля и проростков кукурузы (рис. 1)).
Так, при использовании 100 мкМ Н2О2 активность СДГ у шмелей (В. terrestris) снижалась на 10% и на 15% — у крыс (Я. norvegicus). Более значительными были изменения в активности ферментов растений — активность СДГ картофеля
0 0.1 1.0 Концентрация H2O2, мМ
Рис. 1. Влияние Н2О2 на активность СДГ во фракциях, обогащенных митохондриями. 1 — СДГ л
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.