БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 9, с. 1287 - 1296
УДК 577.352.4
РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В ФОРМИРОВАНИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ Escherichia coli В УСЛОВИЯХ СТРЕССОРНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ
© 2006 г. А.Г. Ткаченко*, О.Н. Пожидаева, М.С. Шумков
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081 Пермь, ул. Голева, 13; факс: (342)210-1963, электронная почта: agtkachenko@iegm.ru
Поступила в редакцию 13.04.06 После доработки 22.05.06
Установлено, что в условиях стрессорных воздействий полиамины снижают проницаемость внешней мембраны Escherichia coli. Отмечено, что в основе этого эффекта лежат по меньшей мере три механизма, действие которых приводит к возрастанию уровня резистентности по отношению к антибиотикам, транспортируемым посредством пориновых каналов (фторхинолоны, Р-лактамы): положительная модуляция транскрипции гена micF, продукт которого, антисмысловая РНК, ингибирует синтез пориновых белков на уровне трансляции; положительное воздействие на содержание в клетках фактора множественной стрессорной устойчивости gs, что сопровождается снижением поринового транспорта путем подавления транскрипции ompF и индукции синтеза кадаверина; прямое ингибирующее воздействие на транспортную активность пориновых каналов. Обнаружено, что в ответ на воздействие различных классов антибиотиков в клетках E. coli значительно возрастает продукция кадаверина, что может быть проявлением окислительного стресса.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: полиамины, стресс, антибиотикорезистентность, пориновый транспорт, gs, экспрессия.
Комплексное воздействие факторов внешней среды на микроорганизмы в местах естественного обитания способствовало формированию у них универсальных механизмов защиты, обеспечивающих выживание в разнообразных стрессовых ситуациях, в том числе связанных с воздействием антибиотиков.
Одним из основных аспектов проблемы множественной лекарственной устойчивости является длительная персистенция антибиотикорезис-тентных микроорганизмов в природных условиях. Это может происходить даже в случае ограничения использования антибиотиков в целях ослабления селективного давления и обусловлено тем, что структуры, ответственные за антибиоти-коустойчивость, одновременно обеспечивают выполнение других жизненно важных функций клетки, в частности поддержание гомеостаза внутриклеточного рН [1, 2]. Известно, что резистентность микроорганизмов к различным видам стресса находится под контролем глобальных регуляторов, которые управляют экспрессией ге-
Принятые сокращения: ИПТГ — изопропил-Р-тио-галактозид, МИК — минимальная ингибиторная концентрация, АСБ — абсолютно сухая биомасса.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
нов адаптации. На основе сходства сигнальных последовательностей ДНК, комплементарных данному регулятору, эти гены объединены в группы (регулоны), ответственные за толерантность по отношению к определенному виду стресса. Значительная степень гомологии аминокислотных последовательностей у таких глобальных регуляторов, как SoxS, MarA и Rob, обусловливает приобретение перекрестной устойчивости к окислительному стрессу, антибиотикам и органическим растворителям при воздействии хотя бы одного из перечисленных факторов [3]. Подобная зависимость описана и для таких видов стресса, как снижение рН, гиперосмотический и тепловой шок [4]. При любом из этих воздействий активируется общий механизм множественного лекарственного выброса, структурно организованный в виде каналообразующих белков типа AcrAB—TolC в оболочке грамотрицательных бактерий, функции которых направлены на активное выведение из клетки повреждающих соединений [5]. Сходная система перекрестной устойчивости действует на уровне ограничения транспорта посредством регуляции количества пориновых каналов внешней мембраны грамот-рицательных микроорганизмов [6, 7]. В этом процессе участвуют двухкомпонентная система
проведения сигнала Епу2/ОшрК [8], а также малая регуляторная РНК ткВ [9].
Ранее было показано, что роль положительных модуляторов экспрессии гена ткВ при супероксидном стрессе играют полиамины, биогенные поликатионы, которые выполняют защитные функции при различных видах стресса [10—12]. Кроме того, было показано, что полиамины могут непосредственно участвовать в регуляции активности транспорта соединений через пориновые каналы, чем объясняется их положительная роль в адаптации микроорганизмов к кислотному стрессу и повышению устойчивости к некоторым видам антибиотиков [13].
Таким образом, складывается впечатление, что одна из основных функций полиаминов в защите микроорганизмов от различных видов стресса может быть связана с ограничением проницаемости оболочки грамотрицательных микроорганизмов на уровне регуляции транспортной активности и количества каналообразую-щих белков. Это дает основание предполагать, что полиамины могут играть существенную роль в формировании множественной антибио-тикорезистентности в условиях разнообразных стрессовых воздействий путем ограничения поступления антибиотиков в клетку.
Цель настоящей работы — исследование механизмов, с помощью которых полиамины могли бы повлиять на формирование множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli, в том числе в условиях стрессорных воздействий.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Использованные в настоящей работе штаммы E. coli с указанием их генотипических свойств и источника получения перечислены в табл. 1.
Уровень генной экспрессии определяли с помощью генных lacZ-слияний, полученных методом трансдукции с использованием в качестве вектора бактериофага X [14, 15].
В целях произвольного включения экспрессии rpoS использовали штамм HS1600DE3Y (pRPOS) E. coli, в котором данный ген индуцировали добавлением в культуру неметаболизи-руемого lac-индуктора, изопропил-р-тиогалак-тозида (ИПТГ) в концентрации 0,3 мМ [16]. Наличие в клетках данного штамма хромосомного слияния osmY (гена-мишени rpoS регулона) с ре-портерным геном lacZ давало возможность судить об эффективности включения rpoS.
Таблица 1. Бактериальные штаммы, использованные в настоящей работе
Штамм E. coli Генотип Источник или ссылка
N9212 (pBR322) N8452 8452, но micF:lacZ rob-, mar, sox+, Kan-R Мартин [3]
M2073 (pBR322) M2076 (pBR322) N7840 RO91 GC4468 (Str-R) mar+ marR::lacZ N7840 (AmarRAB) marR:lacZ mar, rob+, sox+, (Str-R) GC4468 (Str-R) mar-, rob+, sox+, (Kan-R) MC4100(XRZ5: rpoS742:lacZ[hybr]) Хенгге-Аронис [15]
MC4100 F- A(arg-lac) U169 araDI39 rpsLI50 ptsF25 flbB5301 rbsR deoC relAI
HT306 thr-I, araCI4, AspeD98, A(gpt-proA)62, lacYI, gln V44(AS), galK2(Oc), X-, A(SpeB-SpeA)97, A(SpeC-glcB)63, rpsL25(strR), xylA5, mtl-I, thi-I, ampCp-I, cadA2 Тэйбор [18]
SHT03 HT306, но lacZ- DE3 (XRZ5:rpoS742:lacZ[hybr]) Данная работа
HS1600DE3Y (pRPOS) MC4100DE3 rpoSI3::TnI0 osmY::lacZ Шеллхорн [16]
Плазмиды pBR322 pRPOS 4361-bp rep и rop из pMB1 bla из Tn3 tet из pSC101 фрагмент 1298-bp из pGC1, клонированный в pET21, T7lac-промотор в ориентации гена rpoS БНИИ СПГУ Шеллхорн [16]
Для определения зависимости уровня экспрессии rpoS от содержания полиаминов в клетке нами сконструирован штамм E. coli SHT03 на основе зависимого по полиаминам штамма HT306. Для возможности оценки уровня экспрессии генных lacZ-слияний, сконструированных на основе данного штамма, селекционирован хромосомный lacZ^-мутант, не способный синтезировать функциональную ß-га-лактозидазу. Отбор мутантов проводили после выращивания клеток E. coli HT306 на LB-агаре с добавлением 40 мг/мл ортонитрофенил-ß-ra-лактопиранозида, в присутствии которого клетки, обладающие ß-галактозидазной активностью, погибали от токсических продуктов его расщепления [17]. С помощью трансдукции фагом À.RZ5 в выделенный HT306 lac---мутантный штамм перенесено генное слияние rpoS742 : lacZ[hybr]. Фаг, несущий данное генное слияние, предварительно получали путем его индукции при облучении клеток E. coli R091 (À.RZ5 : rpoS742 : lacZ[hybr]) дозой ультрафиолетового облучения ~300 эрг/см2 в течение 20 с [17].
Культивирование микроорганизмов. Перед экспериментом штаммы E. coli, сохраняемые на скошенном LB-агаре, высевали на LB-бульон, содержавший 25 мкг/мл стрептомицина или 50 мкг/мл канамицина. В случае использования штаммов, трансформированных плазмидой pBR322, в среду дополнительно вносили 25 мкг/мл ампициллина и 20 мкг/мл тетрациклина. После 11 ч культивирования в термостате при 37° клетки переносили на среду М-9 с антибиотиком в указанной концентрации и выращивали в течение 13 ч в термостатируемом шейкере (120 об/мин) при той же температуре в колбе объемом 500 мл, содержавшей 300 мл среды М-9. Выросшую культуру использовали в качестве инокулята для посева в колбы объемом 250 мл, содержавшие 100 мл среды М-9, а также антибиотик, и выращивали в тех же условиях. Для выращивания E. coli HT306 и SHT03 к среде М-9 добавляли 1 мкг/мл тиамина, 100 мкг/мл пролина и 1 мкг/мл панто-тената [18].
Биомассу клеток оценивали после предварительного разведения культуры физиологическим раствором по поглощению (OD600) на спектрофотометре СФ-46 («ЛОМО», Россия).
Активность ß-галактозидазы измеряли в клетках, предварительно обработанных смесью DS-Na («Sigma», США) и хлороформа методом Миллера [17].
Содержание полиаминов определяли двумя методами: с помощью тонкослойной хроматографии [12] и ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа высокого давления (модель LC-10Avp, «Shimadzu», Япония). Подготовка
проб перед анализом включала в себя экстракцию с последующей дериватизацией полиаминов с помощью реакции дансилирования [12]. Разделение полиаминов осуществляли на колонке Luna C18(2) размером 250 х 4,6 мм и диаметром частиц 5 мкм («Phenomenex», США) при 25°. Вода и ацетонитрил подавались на колонку со скоростью 1 мл/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 40 до 100% в течение 35 мин с последующим уравновешиванием в течение 10 мин 40%-ным ацетонитрилом. Детекцию дансилированных производных полиаминов проводили на проточном флуоримет-рическом детекторе RF-10AXL («Shimadzu») с установленными длинами волны возбуждения и эмиссии (400 и 516 нм соответственно). Концентрацию полиаминов рас
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.