УДК 612.816:612.822.2
РОЛЬ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ РИАНОДИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ КИНЕТИКИ ВЫЗВАННОГО ОСВОБОЖДЕНИЯ КВАНТОВ АЦЕТИЛХОЛИНА В НЕРВНО-МЫШЕЧНОМ СИНАПСЕ МЫШИ © 2013 г. В. Ф. Хузахметова1, Д. В. Самигуллин1, Э. А. Бухараева1 2*
1Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, 420111, Казань, ул. Лобачевского, 2/31; *электронная почта: elbukhara@gmail.com 2Казанский государственный медицинский университет, 410012, Казань, ул. Бутлерова, 49
Поступила в редакцию 30.04.2013
Для выяснения роли пресинаптических рианодиновых рецепторов в регуляции кинетики вызванного освобождения квантов нейромедиатора в нервно-мышечном соединении мыши исследовали временные параметры фазной синхронной и задержанной асинхронной секреции ацетилхолина при блокировании рианодиновых рецепторов в режиме ритмической стимуляции. Анализ гистограмм синаптических задержек одноквантовых токов концевой пластинки, зарегистрированных в течение 50 мс после развития пресинаптического потенциала действия, показал, что блокаторы ри-нанодиновых рецепторов — рианодин, ТМВ-8 и дантролен — снижали интенсивность как фазного синхронного, так и задержанного асинхронного освобождения медиатора. При этом доля синхронно выделившихся квантов возрастала за счет снижения числа квантов, формирующих задержанное асинхронное освобождение, т.е. происходило перераспределение квантов между синхронной и асинхронной фазами секреции. Блокирование рианодиновых рецепторов вызывало также уменьшение интенсивности флуоресценции специфического кальций-чувствительного красителя Б1ио-3 АМ при ритмической стимуляции двигательного нерва, что свидетельствует о снижении внутриклеточной концентрации ионов кальция. Таким образом, пресинаптические рианодиновые рецепторы участвуют в контроле внутриклеточного содержания ионов кальция в ходе ритмической стимуляции нервного окончания и вносят вклад в модуляцию временных параметров секреции, увеличивая интенсивность преимущественно задержанного асинхронного освобождения нейромедиатора.
Ключевые слова: нервно-мышечное соединение, кинетика освобождения квантов нейромедиатора, рианодиновые рецепторы, Нио-3 АМ, внутриклеточная концентрация Са2+.
Б01: 10.7868/80233475513050058
В синапсах химического типа как центральной, так и периферической нервной системы основным механизмом, который запускает вызванное нервным импульсом освобождение квантов нейромедиатора, является вход в аксоплазму ионов кальция через потенциал-зависимые кальциевые каналы (см. обзор [1]). Взаимодействуя с низкоаффинным кальциевым сенсором, ионы кальция инициируют освобождение от нескольких единиц (в центральных синапсах) до нескольких десятков (в периферических) квантов нейро-медиатора [2, 3]. Это освобождение называют фазным синхронным, и его основное значение состоит в генерации потенциала действия в пост-синаптической клетке [4, 5]. После окончания фазной секреции в ответ на возникновение пре-синаптического потенциала действия повышается уровень выделения квантов из нервного окончания, называемого задержанным асинхронным
освобождением [6, 7], физиологическая роль которого в настоящее время достаточно интенсивно изучается [8, 9]. Свойства и способы модуляции задержанного асинхронного освобождения существенно отличаются от характеристик как спонтанного выделения квантов, наблюдаемого в отсутствие нервной стимуляции, так и от свойств синхронного фазного освобождения [10—12]. Задержанное асинхронное освобождение наиболее выражено при ритмической активности синапса, характерной для его работы в условиях in vivo [13]. Традиционно это явление объяснялось теорией "остаточного" кальция, который не успевает секвестрироваться кальциевыми буферными системами в межстимульный интервал и накапливается в нервном окончании [14]. Однако существование вблизи пресинаптической мембраны гладкого эн-доплазматического ретикулума со специализированными внутриклеточными рианодин-чувстви-
500
ХУЗAХMЕTОBA и др.
тельными кальций-активируемыми кальциевыми каналами, способными регулировать содержание ионов кальция в аксоплазме [15], ставит вопрос об их участии в модуляции вызванного освобождения квантов ацетилхолина [16]. Другим источником повышения внутриклеточной концентрации кальция могут быть рецепторы инозитолтрифосфата [17]. При стимуляции нервного окончания ионы кальция, вошедшие через потенциал-активируе-мые каналы, опосредуют кальций-индуцируемое высвобождение кальция через рианодиновые или инозитолтрифосфатные рецепторы из депо гладкого эндоплазматического ретикулума, которое может усиливать поступивший сигнал и таким способом увеличивать выброс медиатора [17—19].
Роль задержанного асинхронного освобождения в нервно-мышечном синапсе не установлена, и не определен вклад рианодиновых рецепторов в регуляцию кинетики как фазного синхронного, так и задержанного асинхронного вызванного освобождения ацетилхолина. Ранее нами было показано, что кинетика секреции квантов в синапсах лягушки и мыши зависит от концентрации внеклеточного кальция и частоты стимуляции двигательного нерва [20, 21], а также изменяется при введении экзогенных кальциевых буферов [22, 23]. Эти данные указывают на возможное участие рианодиновых рецепторов в регуляции временных параметров вызванной секреции квантов. Можно предположить, что выделение квантов медиатора с большими синаптическими задержками обусловлено активацией рианодиновых рецепторов и последующим взаимодействием освобождаемого ими кальция с высокаффинным кальциевым сенсором, управляющим асинхронной секрецией. Для проверки этой гипотезы исследованы временные параметры фазного и задержанного асинхронного освобождения квантов ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе мыши в условиях блокирования рианодиновых рецепторов. Сопоставление изменения внутриклеточного содержания ионов кальция, оцениваемого с помощью флуоресцентного метода, и временных параметров синхронного и асинхронного выделения квантов показало, что при блокировании рианодиновых рецепторов снижение кальциевого ответа сопровождается уменьшением количества освобождающих квантов ацетил-холина, в большей степени выраженным в фазе задержанной асинхронной секреции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на изолированном нервно-мышечном препарате диафрагмальной мышцы белых мышей обоего пола с массой тела 20—25 г. Животные предварительно были анестезированы эфиром и декапитированы в соответствии с этическими требованиями к работе с лабораторными животными. Препарат помещали в
экспериментальную ванночку, через которую протекал физиологический раствор следующего состава (в hM): NaCl 150.0, KCl 5.0, CaCl2 0.5, HEPES 5.0, MgCl2 5.0, глюкоза 11, pH 7.3-7.4. Опыты проводили при температуре 20.0 ± 0.3°C, которую поддерживали с помощью элементов Пельтье. С использованием стандартной микроэлектродной техники внеклеточно регистрировали токи действия нервного окончания и одно-квантовые токи концевой пластинки ^КП), вызванные стимуляцией двигательного нерва с частотами 0.5 и 15 имп./с в контрольном физиологическом растворе, и после 20 мин действия блокаторов рианодиновых рецепторов. В исходных условиях в растворе, перфузирующем нервно-мышечный препарат, содержание ионов кальция составляло 0.5 и 5 mM магния, что позволяло наблюдать одноквантовые TKП [4]. Оценивали значения истинной синаптической задержки -временного интервала между пиком натриевой компоненты тока действия нервного окончания и началом одноквантового TKH на уровне 20% от максимального значения амплитуды ответа (рис. 1а, вставка). TKП регистрировали на протяжении 50 мс после нервного импульса. Анализировали гистограммы распределения синаптических задержек, для их сравнения строили кумулятивные кривые, а также аппроксимировали спад гистограмм экспонентами, чтобы оценить количество ответов, относящихся к синхронной и асинхронной фазам секреции, как описано ранее [23]. Ответы, возникающие в пределах 3 мс от пика натриевой компоненты и формирующие первую экспоненту спада гистограммы синаптических задержек, составляли фазное синхронное освобождение. Сигналы с задержками от В до 50 мс, формирующие третью экспоненту спада гистограммы, представляли задержанное асинхронное освобождение квантов медиатора [23]. Оценивали количество квантов, составляющих синхронное и задержанное асинхронное освобождение в исходном физиологическом растворе и через 20 мин после начала перфузии нервно-мышечного препарата блокаторами рианодиновых рецепторов. Для блокады рианодиновых рецепторов использовали рианодин (3 мкM), TMB-8 (8-(N,N-diethylamino)octyl-3,4,5-trimethoxybenzoate HCl) (25 мкM) и дантролен (20 мкM) (все Sigma Ald-rich, США). Рианодин разводили в растворе ди-метилсульфоксида (DMSO, Molecular Probes, США), конечная концентрация которого не превышала 0.1%. В контрольных экспериментах, проведенных предварительно, показано, что на протяжении более 2 ч регистрации DMSO в такой концентрации не оказывал статистически значимого влияния на оцениваемые параметры квантовой секреции.
Для анализа изменения внутриклеточного содержания ионов кальция при блокировании риа-нодиновых рецепторов с помощью специфиче-
ского кальций-чувствительного красителя использовали нервно-мышечный препарат levator auris longus мыши. Этот препарат наиболее подходит для флуоресцентной микроскопии в силу своих морфологических особенностей — он имеет небольшую толщину и большое количество нервных терминалей на поверхности мышцы.
Раствор для загрузки, приготовленный на основе физиологического раствора, содержал 20 мкМ кальциевого красителя Fluo-3 AM, растворенный в 1 мM DMSO и 0.02% плюрониловой кислоты (Molecular Probes, США). Инкубационный раствор также содержал 20 мкМ TPEN (tet-rakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine) (Molecular Probes, США) для хелатирования тяжелых металлов и ограничения связывания этих ионов с Fluo-3 АМ. Препарат инкубировали в этом растворе в течение б0 мин при температуре 15°С, затем отмывали физиологическим раствором в течение 20 мин.
Изменения интенсивности флуоресцентного сигнала регистрировали при помощи конфокального лазерного сканирующего м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.