ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 3, с. 376-381
УДК 581.132
РОЛЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕАМИНИРОВАНИЯ В МОБИЛИЗАЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ СУБСТРАТОВ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ
КЛЕЩЕВИНЫ
© 2007 г. В. Н. Попов*, А.Т. Епринцев*, Д. Н. Федорин*, О. Ю. Фоменко*,
А. У. Игамбердиев**
*Воронежский государственный университет, Воронеж, 394693, Россия,
e-mail: pvn@bio.vsu.ru
**Department of Plant Science, University of Manitoba, Winnipeg, Manitoba, R3T 2N2, Canada,
e-mail: igamberd@cc.umanitoba.ca Поступила в редакцию 16.10.2006 г.
Исследовали метаболизм 1,4- и 2,3-14С-сукцината и активность дегидрогеназы янтарного полуальдегида (КФ 1.2.1.16) в прорастающих семенах клещевины (Ricinus communis L.). Метаболизм сукцина-та происходил с участием сукцинатдегидрогеназы (КФ 1.3.99.1) и был чувствителен к метаболитам шунта у-аминомасляной кислоты. Имело место значительное накопление метки в аминокислотах, что указывает на активные процессы переаминирования. Из эндосперма клещевины была очищена дегид-рогеназа янтарного полуальдегида, исследованы ее кинетические свойства. Сделан вывод, что активная мобилизация дыхательных субстратов при прорастании клещевины достигается через интенсивное переаминирование кетокислот цикла Кребса и включает активное функционирование ГАМК-шунта.
Значительная часть научного наследия В.Л. Кре-товича посвящена исследованию процессов переаминирования в метаболизме растений. Одним из первых В.Л. Кретович показал, что дыхательный метаболизм в активно функционирующих тканях непосредственно связан с переаминированием и формированием значительных пулов аминокислот. Более того, цикл трикарбоновых кислот шунтируется через формирование у-аминомасляной кислоты (ГАМК) и роль и функционирование этого пути метаболизма представляли значительный интерес для В.Л. Кретовича. В более ранних работах [1-3] исследовались процессы переаминирования в семенах и проростках. В дальнейшем было установлено, что переаминирование глиоксилата играет важную роль в метаболизме жирозапаса-ющих тканей проростков, что означает участие глиоксилатного цикла не только в глюконеогенезе, но и в синтезе аминокислот [4]. Это в дальнейшем было подтверждено в опытах по распределению радиоактивной метки в прорастающих семенах злаков, где сукцинат, образующийся в глиоксилатном цикле, окисляется непосредственно в глиоксисо-мах [5] и далее используется преимущественно для биосинтеза аминокислот [6, 7].
Помимо переаминирования глиоксилата, в прорастающих семенах образуются значительные количества ГАМК. Семена функционируют в условиях частичной гипоксии, и это объясняет функционирование данного пути метаболизма. Кретович и др. [9] установили, что глиоксилат активно переаминируется с ГАМК с образованием
полуальдегида янтарной кислоты (ПЯК), показав, что оба пути (глиоксилатный цикл и ГАМК-шунт) функционально связаны. Было сделано предположение, что ПЯК в дальнейшем может служить предшественником глутамина [9]. Хотя сейчас считается, что реакция, катализируемая дегидрогена-зой ПЯК (КФ 1.2.1.16), физиологически необратима [10], в определенных условиях процесс, описанный В.Л. Кретовичем, может иметь место [11].
В нашей работе мы продолжили исследования процессов переаминирования в прорастающих семенах, начатые В.Л. Кретовичем в 1960-е годы. Нам представлялось интересным изучить, насколько сбалансированы процессы окисления жирных кислот, цикла трикарбоновых кислот и переаминирования в жирозапасающих проростках клещевины. Основным поставщиком оксалоацетата для глюконеогенеза является переаминирование ас-партата с 2-оксоглутаратом, а сукцинат, поставляемый глиоксилатным циклом, может, на наш взгляд, обеспечивать образование органических кислот и их метаболизацию в аминокислоты.
В связи с тем, что жирозапасающая ткань проростка находится в гипоксических условиях, при которых из-за неполного окисления дыхательных субстратов происходит подкисление внутриклеточной среды, активация реакций, связанных с метаболизмом восстановленного азота, может обеспечивать также регуляцию внутриклеточного рН. Показано, что накопление ГАМК влияет на регуляцию благодаря поглощению протона в глутаматдекарбоксилазной реакции [12, 13].
Цель работы - изучение роли процессов пере-аминирования в метаболизме дыхательных субстратов (в первую очередь, сукцината) в прорастающих семенах клещевины.
МЕТОДИКА
Объект исследования. В работе использовали проростки клещевины (Ricinus communis L.) сорта "Казачка", выращенные без света в водной культуре в термостате при 24°С.
Влияние ингибиторов на функционирование метаболических путей, связанных с превращениями сукцината в глиоксилатном цикле. 2-миллиметровые высечки эндосперма 4 сут проростков клещевины инкубировали в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 5.8), содержащем 1 мМ 1,4-14С-сук-цинат (исходная радиоактивность 0.25 МБк/мл) и ингибиторы метаболизма: для ингибирования сукцинатдегидрогеназы - 8 мМ теноилтрифтор-ацетон, аконитатгидратазы - 5 мМ фторацетат, 2-оксоглутаратдегидрогеназы и пируватдегидро-геназы - 2 мМ арсенит натрия, аминотрансфераз -1 мМ аминооксиацетат.
Радиоизотопные исследования. 2-миллиметровые поперечные высечки растительного материала инкубировали с 3 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 5.8), содержащего 1 мМ меченого субстрата (исходная радиоактивность 0.25 МБк/мл), ингибиторы метаболизма, 1 мМ глутаминовую кислоту или 1 мМ ГАМК. Учет 14С02, выделяющегося в ходе метаболизма 1,4-14С-сукцината, проводили при 25°С в течение 2.5 ч с интервалом отбора проб 30 мин. Выделяющийся С02 улавливали 10%-ным раствором NaOH с помощью респираторной установки, либо использовали пузырьки, закрытые резиновой крышкой с фильтром GFF ("Whatman", Англия) диаметром 5 мм, смоченным моноэтаноламином. Использовали радиоактивные соединения фирмы "Изотоп" (Россия). Радиоактивность проб просчитывали на сцинтилля-ционном счетчике СБС-2 (Россия) в сцинтилляци-онной жидкости ЖС-8И (Россия).
Исследование превращения 2, 3-14С -сукцината.
2,3-14С-сукцинат вводили в растительные ткани при тех же условиях, что и в опытах по декарбок-силированию. После 2-часовой инкубации радиоактивной метки растительный материал фиксировали 10-кратным объемом кипящего 96%-ного этанола (до конечной концентрации спирта 80%), фильтровали через стеклянный фильтр, затем спирт отгоняли, а остаток количественно переносили в 5 мл воды и центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 9000g. Супернатант использовали для дальнейшего анализа.
Разделение аминокислот, органических кислот и сахаров на фракции. Разделение проводили путем последовательного пропускания экстрак-
тов через колонки с ионообменными смолами КУ-2 и АВ-17 ("Токем", Россия). Хроматографи-ческое разделение аминокислот и органических кислот осуществляли на бумаге FN-15 (Германия) в соответствующих системах растворителей [14].
Очистка дегидрогеназы ПЯК. Очистку фермента проводили при 0-4°С. 1 г эндосперма клещевины гомогенизировали в 10 мл среды выделения (рН 7.5), содержащей 0.4 М сахарозы, 50 мМ трис-HCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол и 1 мМ ЭДТА. Для осаждения неразрушенных тканей использовали центрифугирование при 1000 g в течение 5 мин. Из гомогената дифференциально осаждали орга-нельные фракции последовательным центрифугированием в течение 5 мин при 4000 g и 15 мин при 15000 g. Для проведения гель-фильтрации использовали колонку с сефадексом G-25 medium ("Pharmacia", Швеция), уравновешенную 10 мМ трис-HCl-буфером (рН 7.5), содержащим 1 мМ дитиотрейтол и 1 мМ MgCl2. Обессоленный раствор фермента наносили на колонку (1.1 х 20 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (DE-32, "Whatman", Англия). При элюции фермента с колонки использовали ступенчатый градиент концентрации KCl в 10 мМ трис-НО-буфере, рН 7.5. Среда элюции также содержала 1 мМ ЭДТА и 1 мМ MgCl2.
Активность дегидрогеназы янтарного полуальдегида. Активность определяли спектрофото-метрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования НАДН. Cреда колори-метрирования содержала 50 мМ трис-HCl, рН 7.8, 0.2 мМ ПЯК ("Sigma", США), 0.15 мМ НАД ("Merck", Германия). Активность (Е) выражали в мкмолях образовавшегося НАДН в минуту.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования возможных путей метаболизма сукцината в обход трикарбоновой ветви цикла Кребса нами изучалось влияние метаболитов ГАМК-шунта на выделение 14С02 при введении 1,4-14С-сукцината в эндосперм клещевины (рис. 1). Показано, что введение в инкубационную среду 1 мМ ГАМК увеличивало радиоактивность выделяющегося 14С02 за 1.5 ч на 40%, а за 2.5 ч почти на 20%. Добавление 1 мМ глутамата вызывало интенсификацию декарбоксилирования продуктов метаболизма радиоактивного сукцината на 70-90 % в течение всего периода инкубации. Таким образом, можно предположить, что интенсификация метаболизма янтарной кислоты в эндосперме клещевины связана с ГАМК-шунтом.
Введение ингибиторов метаболизма оказывало существенное влияние на включение и распределение радиоактивной метки во фракции аминокислот (рис. 2). Фторацетат, ингибирующий аконитатгид-ратазу, практически не влиял на радиоактивность
Имп./мин г сырой массы
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
ч
Рис. 1. Декарбоксилирование 1,4-14С-сукцината в высечках эндосперма клещевины при введение субстратов ГАМК-шунта (имп./мин г сырой массы); 1 - контроль, 2 - в присутствии 1 мМ глутамата, 3 - 1 мМ ГАМК.
аминокислот. Однако при этом радиоактивность ряда аминокислот заметно увеличивалась. Особенно возрастало включение 14С-метки в аланин, радиоактивность которого увеличивалась почти в 9 раз. Также увеличивалась радиоактивность глутамина и аспарагина (почти втрое), глутамата и аспартата (примерно в два раза) и лизина (в четыре раза). Радиоактивность ГАМК уменьшилась почти в 1.5 раза.
Ингибирование 2-оксоглутаратдегидрогена-зы и пируватдегидрогеназы арсенитом вызывало уменьшение радиоактивности фракции аминокислот. Арсенит вызывал накопление радиоактивной
14С-метки в аспартате и глутамате (радиоактивность увеличилась более чем вдвое), их амидах (наблюдалось 3-кратное увеличение радиоактивности), аланине (радиоактивность увеличивалась в че
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.