ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2008, № 6, с. 736-745
^ ФИЗИОЛОГИЯ
ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 576.3
РОЛЬ РЕГУЛЯТОРНОГО БЕЛКА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ РОГОВИЦЫ ГЛАЗА БЫКА, В АКТИВАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ РЕГЕНЕРАЦИИ РОГОВИЦЫ in vitro
© 2008 г. Д. В. Маргасюк*, М. С. Краснов**, И. А. Ямсков*, В. П. Ямскова**
*Институт элементоорганических соединений им. А.И. Иесмеянова РАИ, 119991 Москва, ул. Вавилова, 28 **Институт биологии развития им. И.К. Кольцова РАИ, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: emrbmsk@mail.ru Поступила в редакцию 17.10.2007 г.
В работе было изучено влияние высокоочищенного регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка (РБР), на состояние роговицы крысы и тритона при различных способах культивирования. Было показано, что у амфибий влияние РБР выражается в стимуляции как клеток эпителия лимба при роллерном культивировании, так и клеток базального слоя эпителия роговицы при роллерном и стационарном культивировании. У млекопитающих в условиях роллерного культивирования роговиц РБР не оказывает влияния на малодифференцированные клетки лимба, но действует на прогениторные клетки базального слоя роговицы, интенсифицируя их переход в дифференцированные эпителиальные клетки. При стационарном культивировании роговицы крысы на подложке не было выявлено влияния РБР на активацию клеточных источников регенерации данной ткани.
Ранее из ткани роговицы глаза быка был выделен регуляторный белок (РБР), обладающий биологической активностью в сверхмалой дозе (СМД) (Маргасюк и др., 2005). По совокупности физико-химических свойств этот белок можно отнести к ранее исследованной группе белков, биологически активных в СМД (10-8-10-14 мг/мл) и обнаруженных в различных тканях животных и растений (Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999, 2001; Назарова и др., 2005; Borisenko et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Nazarova et al, 2007; Yamskova et al, 2007a, b).
Важнейшей характеристикой регуляторных белков (РБ) данной группы является проявление ими биологической активности в СМД: РБ оказывают воздействие на адгезию, миграцию, пролиферацию и дифференцировку клеток. Например, сывороточный РБ стимулирует адгезию и пролиферацию эмбриональных фибробластов и гепатоцитов млекопитающих in vitro (Буеверова и др., 1985; Ямскова, Резникова, 1991; Туманова и др., 1996); РБР стимулирует пролиферацию и миграцию эпителиальных клеток роговицы глаза взрослого тритона при травме in vivo и in vitro (Маргасюк и др., 2005; Margasyuk et al., 2007); РБ пигментного эпителия способствует поддержанию адгезии и статуса клеточной дифференцировки пигментного эпителия глаза тритона in vitro (Краснов и др., 2003а). Следует отметить, что биологическая активность РБ, как у многих сигнальных молекул, характеризуется только тканевой специфичностью, но отсутствием видо-
вой (Ямскова, Резникова, 1991; Guidebook ..., 1994; Краснов и др., 2003а, б).
В работе было изучено действие РБР глаза быка на стволовые и прогениторные клетки этой ткани. Для этого были использованы два способа органо-типического культивирования роговиц глаз позвоночных: роллерное и на подложке. В каждом случае исследовалось также влияние РБР на состояние роговицы при культивировании с областью лимба и без нее (Margasyuk et al., 2007).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали следующие реактивы и материалы: среда 199 (Институт полиомиелита и вирусного энцефалита РАМН, Москва, Россия), сыворотка плодов коров (BioLot, Россия), буфер Hepes (Sigma, Германия), 4%-ный раствор сульфата гентомицина (Дальхимфарм, Россия), наркоз для амфибий трикаин метансульфонат (Sigma), мембранные фильтры "GV" (Millipore, США), целлюлозные фильтры "A/E" (Gelman, США), микрометрическая линейка (Carl Zeiss, Германия), бинокуляр МБС-10 (ЛОМО, Россия), роллер RM5 (Assistant, Германия), колонка для изоэлек-трофокусирования LKB440 (LKB, Швеция).
Исследуемый РБ выделяли из роговицы глаза быка по ранее разработанной методике (Маргасюк и др., 2005; Margasyuk et al., 2007). Детекцию белка и определение биологически активной концентрации проводили методом биотестирования,
который был разработан для идентификации РБ данной группы (Ямскова и др., 1977).
Исследование специфической активности РБ, выделенного из роговицы глаза быка, проводили на органной культуре роговиц глаза тритона и крысы. Половозрелых тритонов Р1еыгойе1ез ^аШ обоего пола получали из аквариального комплекса ИБР РАН, а крыс породы обоего пола весом 220-250 г из вивария ИБР РАН. В каждой серии экспериментов на каждую точку фиксации брали по 6 роговиц, полученных от 3 животных.
Тритонов наркотизировали в 0.1%-ном растворе трикаин метансульфоната (МБ-222), проводили энуклеацию глаз при стандартном лабораторном освещении. Изолированные глаза помещали в стерильные чашки Петри (3.5 см) в бессывороточную среду для амфибий (среда 199-70%, вода дистиллированная - 30%).
Крысам давали эфирный наркоз, далее дека-питировали, энуклеированные глаза помещали в стерильные чашки Петри (3.5 см) в бессывороточную среду 199.
Под контролем бинокуляра производили прокол на латеральной поверхности глаза глазным скальпелем с пикообразным наконечником, в сделанный прокол вставляли микрохирургические ножницы и вырезали роговицу по окружности. Для одной серии экспериментов роговицы вырезали без области лимба, для второй - вместе с ростовой зоной лимба.
Культивирование роговиц тритона проводили в условиях, ранее разработанных для других тканей глаза хвостатых амфибий (Краснов и др., 2003а; Григорян и др., 2005). Среда для культивирования тканей глаза тритона состояла из 350 мл среды 199, 150 мл бидистиллированной кипяченой воды, 50 мл сыворотки плодов коров, 0.15 мл 1 М буфера Иерее и 1 мл 4%-ного раствора сульфата гентамицина. Культивирование роговиц крыс проводили в среде 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 0.008% сульфата гентамицина. Среда культивирования (V = = 12 мл на одну роговицу) перед внесением во флаконы объемом 15 мл проходила холодную стерилизацию через мембранные фильтры с размером пор 0.22 мкм. При стационарном культивировании полученные роговицы помещали на целлюлозные фильтры, предварительно отмытые в 70%-ном этаноле, а затем в культуральной среде. Флаконы закрывали стерильными крышками, затем пленкой РагаШш М (США), накрывали алюминиевой фольгой и ставили в термостат.
Роллерное культивирование роговиц проводили на роллере ЯМ5 со скоростью вращения 35 об./мин во флаконах объемом 10 мл с темным стеклом (V среды = 4 мл на одну роговицу) в темноте при температуре 22°С в течение 7 сут без
смены среды. Роговицы фиксировали в растворе Буэна и обезвоживали. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином. На микропрепаратах подсчитывали количество слоев эпителиальных клеток, а также, используя микрометрическую линейку, измеряли толщину эпителия и стромы, выражая их в %-ном отношении к общей толщине роговицы (т.н. относительная толщина). Данные морфометрических исследований оценивали статистически с использованием программы Origin, сравнивали параметры опытных культур с контролем и интактной роговицей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Было исследовано воздействие на клеточные источники регенерации роговицы высокоочищенной фракции РБР. По данным SDS-электрофореза в по-лиакриламидном геле основным компонентом фракции являлся низкомолекулярный белок (Mr < < 14 кДа), который характеризовался временем удержания 3.18 мин при обращено-фазовой ВЭЖХ (Маргасюк и др., 2005; Margasyuk et al, 2007). Методом биотестирования было установлено, что мем-бранотропное действие РБР проявляется в интервале концентраций, соответствующих 10-1°-10~12 мг/мл (Маргасюк и др., 2005). В настоящем исследовании было изучено биологическое действие РБР в концентрации 10-11 мг/мл.
Определение таких параметров, как относительная толщина эпителия роговицы и количество слоев клеток в нем, позволяет характеризовать изменение общего количества клеток эпителия в зависимости от условий культивирования. Относительная толщина стромы (в сравнении с интактной роговицей) позволяет оценить изменение уровня ее гидратации в условиях культивирования. Возрастание величины этого параметра свидетельствует об увеличении гидратации стромы, что является негативным процессом, связанным с нарушением барьерной функции эндотелия роговицы (Bonanno, 2003). Изменение такого параметра, как относительная толщина эпителия, может являться результатом как изменения степени гидратации стромы, так и изменения количества слоев клеток эпителия за счет пролиферации или, наоборот, гибели. Поэтому общую оценку состояния роговицы после культивирования можно дать лишь с учетом всех параметров. Поскольку эндотелий является однослойной структурой, состоящей из плоских гексагональных клеток, количественная оценка его состояния не представлялась информативной и потому не проводилась.
Влияние РБР на состояние роговицы глаза тритона при роллерном культивировании без области лимба. После извлечения из культуральной среды роговицы глаза тритона представляли собой практически плоские ткани. На гистологических срезах роговицы как в опыте, так и в кон-
Рис. 1. Роговица тритона: интактная (а), при роллерном культивировании без лимбальной области в контроле (б) и после действия РБР (в), с прилегающей областью лимба в контроле (г) и после действия РБР (д). Ув.: об. х20, ок. х10 (для рис. 1-4).
троле представляли собой двуслойную структуру, состоящую из эпителия и стромы (рис. 16, 1в). Эн-дотелиальный слой деградировал и не замещался мигрирующими клетками эпителия. Эпителиальный пласт состоял из 2-3 слоев клеток, адгезия базального слоя эпителия к строме была нарушена, причем в контроле на некоторых гистологических препаратах эпителий вообще отсутствовал. Строма сохраняла волокнистую структуру, однако порядок расположения волокон стромы был нарушен, а количество живых фибробластов было невелико как в опыте, так и в контроле. Результаты измерений, представленные в табл. 1, показывают, что в опыте (при воздействии РБР) относительная толщина эпителиального слоя была приблизительно в 4 раза боль
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.