БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 5, с. 672 - 680
УДК 577.1
РОЛЬ С-КОНЦЕВОГО ФРАГМЕНТА ТРАНСТИРЕТИНА ЧЕЛОВЕКА В АНОМАЛЬНОМ ФИБРИЛЛОГЕНЕЗЕ
© 2006 г. К.В. Соловьев1*, А.А. Гастева1, В.В. Егоров1, Т.Д. Алейникова1, А.К. Сироткин2, А.Л. Шварцман1, М.М. Шавловский1
1 Отдел молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН, 197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12; факс: (812)234-9489, электронная почта: kak-nikak@mail.ru 2 Научно-исследовательский институт гриппа РАМН, 196376 Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 15/17
Поступила в редакцию 28.09.05 После доработки 08.12.05
Исследовали фрагменты полипептидной цепи рекомбинантного транстиретина (ТТР) с заменой (Е55Р), участвующие в формировании аномальных фибрилл этого белка. Показано, что в очищенных препаратах синтезированного в бактериальной системе ТТР(Е55Р) в условиях, оптимальных для фибриллогенеза, но в отсутствие ингибиторов протеаз фибриллы не образуются. Установлено, что причина потери способности ТТР к фибриллогенезу — ограниченный протеолиз, приводящий к отщеплению С-концевого фрагмента полипептидной цепи ТТР длиной ~18 аминокислотных остатков. Протеолиз осуществляет, скорее всего, бактериальная сериновая эндопептидаза воИВ (ЕС 3.4.21), идентифицированная в препаратах ТТР с помощью метода МАЕБЕТОЕ Предполагается, что наличие С-концевого фрагмента полипептидной цепи ТТР является критическим для образования аномальных фибрилл.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: транстиретин, ТТР(Е55Р), фибриллогенез, агрегаты, амилоидозы.
В последнее время все больше внимания уделяется ряду тяжелейших заболеваний человека — амилоидозам. Амилоидозы характеризуются отложением в некоторых органах и тканях нерастворимых белковых агрегатов, причем этот процесс сопровождается прогрессивными дегенеративными изменениями [1]. Отложения (амилоиды) состоят главным образом из определенных белков, формирующих фибриллы, которые в свою очередь сорбируют целый ряд других компонентов [1]. Хотя амилоидные отложения известны в медицине уже давно [2], детальное изучение аномального белкового фибрил-логенеза стало возможным совсем недавно.
Принятые сокращения: ТТР — транстиретин; TTP(L55P) — транстиретин с аминокислотной заменой лейцина в 55-м положении на пролин; РСБ — ретинолсвя-зывающий белок; ThT — тиофлавин Т; IPTG — изопропил-P-D-тиогалактопиранозид; PBS — физиологический буферный раствор (0,15 М NaCl, 25 мМ Na-фосфат, рН 7,4); MALDI-TOF — Matrix Assisted Laser Desorption /Ioniza-tion—Time cf Flight; ЭФ — электрофорез. * Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
Способность к аномальному фибриллогенезу — это свойство, проявляющееся только в определенных условиях и связанное с конформацион-ными изменениями в белке [3]. Изменения могут носить вторичный характер (индукция аномальных конформеров, как в случае прионовых заболеваний) и быть первичными, обусловленными, например, генетическими причинами или нарушениями фолдинга белка [4].
К белкам, склонным к фибриллогенезу, относится транстиретин человека [5], основными функциями которого в организме считаются транспорт тироксина в крови и в спинно-мозго-вой жидкости [6], а также опосредованное рети-нолсвязывающим белком участие в транспорте витамина А [5]. Способность ТТР образовывать фибриллы in vitro проявляется при малых значениях рН среды [7] и при высоких концентрациях солей в растворе [8]. Особую склонность к фибриллогенезу имеют некоторые мутантные формы ТТР [9]. Фибриллы мутантных форм ТТР найдены при таких заболеваниях, как семейная полинейропатия [10], кардиомиопатия [9] и старческие системные амилоидозы [11].
Самым опасным для человека, из всех известных на данный момент амилоидогенных форм ТТР, считается белок, в полипептидной цепи которого лейцин-55 заменен на пролин (L55P) [12].
ТТР — гомотетрамер (общая молекулярная масса 55 кДа), состоящий из четырех одинаковых субъединиц, длина полипептидной цепи каждой из которых составляет 127 аминокислотных остатков [5]. Вторичная структура мономера ТТР представлена преимущественно р-слоями [13]. Одна молекула тетрамерного ТТР способна взаимодействовать одновременно с двумя молекулами РСБ [5, 14], а канал связывания тироксина находится в самом центре тетра-мера [5, 8, 15]. В литературе описано несколько моделей фибриллогенеза ТТР [16—19], имеющих главным образом гипотетический характер. Однако известно, что только при нарушении своей четвертичной структуры молекула ТТР приобретает способность образовывать фибриллы. Предполагается, что в определенных условиях образующиеся из молекул ТТР димеры [16] или мономеры [17—19] не формируют вновь тетра-мерные структуры, а, взаимодействуя друг с другом, агрегируют в мультимолекулярные структуры. Агрегация начинается со стадии «нуклеа-ции», далее формируются префибриллярные формы — «протофибриллы» [20, 21], из которых и вырастают зрелые амилоидные фибриллы.
Литературные данные свидетельствуют о наличии двух фрагментов в полипептидной цепи транстиретина: ТТР(10-19) и ТТР(105-115), которые сами по себе in vitro способны к фибрилло-генезу [22, 23]. По данным рентгеноструктурного анализа вторичная структура каждого пептида внутри молекулы ТТР представляет собой один Р-тяж, без изгибов и поворотов [22]. Электронная микроскопия фибрилл, образованных пептидом ТТР(10—19), указывает на то, что они представляют собой длинные (>1000 нм) спиралевидные структуры диаметром ~10 нм [24]. Воздействие 3 М мочевиной на эти фибриллы приводит к нарушению их упорядоченной структуры. Однако такие частично разрушенные фибриллы формируют протофибриллы диаметром 3—4 нм, которые чрезвычайно устойчивы к воздействию денатурирующих веществ [25]. Фибриллы, полученные из пептида ТТР(105—115), морфологически сходны с фибриллами ТТР(10—19) и тоже устойчивы к действию денатурантов [26].
Пептид ТТР(10—19) входит в структуру сайта связывания тироксина [22], а пептид ТТР (105—115) — в состав участка связывания мономеров между собой в структуре ТТР-тетрамера. Несмотря на определенный прогресс в исследованиях фибриллогенеза ТТР, до настоящего времени не решен вопрос о том, какие именно
участки полипептидной цепи мономеров ТТР взаимодействуют между собой при формировании амилоидных фибрилл.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение и очистка рекомбинантного ТТР(L55P). ТТР(Ь55Р) получали из культураль-ной среды, в которой выращивали клетки Escherichia coli BL21(DE3), трансформированные экспрессионной конструкцией ТТР^55Р)/ /pET22b+ [27]. Вектор был сконструирован так, что белок синтезировался вместе с «лидерным пептидом», транспортировавшим его из клетки в среду LB с последующим отщеплением [27]. Клетки изначально росли в течение ночи в 10 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) при 37°. Полученный инокулят был разведен в 100 раз свежей средой, и культура в условиях аэрации при 37° росла до достижения ^600 1. Далее синтез ТТР индуцировали добавлением IPTG (до конечной концентрации 1 мМ) и культивирование продолжали в течение ночи при 37° в условиях аэрации. После отделения бактериальных клеток (путем центрифугирования в течение 15 мин при 10 000 g) супернатант подвергали ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ A-50 Sephadex, уравновешенной PBS. ТТР^55Р) элюировали линейным градиентом (150—350 мМ NaCl). Фракции, содержавшие ТТР^55Р) (главный пик), концентрировали на мембране РМ-10. Затем материал подвергали гель-фильтрации на колонке с Toyopearl HW-50 (100 см х 1,6 см), уравновешенной PBS. Фракции, соответствовавшие ТТР, концентрировали до 2 мг/мл и замораживали при —70° для длительного хранения. Концентрацию ТТР определяли спектро-фотометрически при е280 16 315 М-1 • см-1.
Из 1 л культуральной жидкости получали 20-30 мг очищенного ТТР. Степень очистки ТТР проверяли ЭФ в ПААГ [28]. Для эксперимента отбирались препараты с содержанием ТТР >97%.
Для изучения ЭФ-подвижности мономерных форм ТТР пробу прогревали в течение 1 мин на водяной бане (при 100°) в присутствии меркаптоэтанола. При изучении подвижности тетрамерных форм ТТР пробы не прогревали и не обрабатывали меркаптоэтанолом.
Формирование фибрилл ТТР(L55P) in vitro. Для получения фибрилл ТТР^55Р) с конечной концентрацией 2 мг/мл инкубировали в 15 мМ Na-фосфатном буфере, рН 6,0, содержавшем 0,2 М NaCl и 1 мМ ЭДТА, в течение 12 ч при 37° (раствор постоянно перемешивали) [29]. Инкубацию осуществляли с добавлением ингибитора протеаз
(«Proteases inhibitor cocktail» For the complete inhibition of proteases during extractions from animal and plant tissues or cells, yeast and bacteria, Cat. № 1 836 153, Boehringer Mannheim) и без него.
Флуоресцентный анализ фибрилл ТТР при связывании с ThT. Флуоресцентный анализ фиб-риллогенеза осуществляли на спектрофлуори-метре (НИИ цитологии РАН, Санкт-Петербург) при длинах волн возбуждения и регистрации 435 и 482 нм соответственно [30]. Объем пробы для измерения флуоресценции составлял 400 мкл. К 10 мкл раствора фибрилл ХГР добавляли 390 мкл (25 hM Na-фосфатного буфера, рН 8,0) и 1 мкл водного раствора ThT (исходная концентрация 40 мкг/мл).
Электронная микроскопия фибрилл ТТР.
Электронную микроскопию осуществляли на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Препараты готовили по стандартной методике негативного контрастирования: каплю исследуемого образца наносили на парафильм, сверху на каплю помещали медную сетку с углеродной подложкой; после 15 с адсорбции сетку дважды отмывали дистиллированной водой, контрастировали 1,5%-ным раствором натриевой соли фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,4) и высушивали при комнатной температуре.
Масс-спектроскопия MALDI-TOF белков и продуктов их трипсинолиза. Масс-спектрометри-ческий анализ осуществляли на масс-спектрографе Bruker (НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Москва).
Препараты частично протеолизованного и непротеолизованного ХГР подвергали препаративному электрофорезу в ПААГ в неденатуриру-ющих условиях. Контрольную дорожку отрезали от геля и окрашивали кумасси R-250. В соответствии с расположением прокрашенной зоны, из неокрашенного ПААГ вырезали полоску, содержавшую белок.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.