БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 9, с. 1269 - 1277
УДК 577.023+577.322.23
РОЛЬ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЦИТОХРОМА Р450scc В ФОЛДИНГЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ*
© 2006 г. Н.В. Струшкевич1, И.Н.Гарностай1, Г.И. Лепешева2, С.А. Усанов1**
1 Институт биоорганической химии НАН Беларуси, 220141 Минск, ул. Акад. Купревича, 5/2; факс: 375(172)63-7274, электронная почта: usanov@iboch.bas-net.by 2 Department of Biochemistry, Vanderbilt University, Nashville, TN, USA; E-mail: galina.i.lepesheva@vanderbilt.edu
Поступила в редакцию 07.04.06
Для выяснения роли остатка Arg472 и С-концевой последовательности зрелой формы холестерингидрокси-лирующего цитохрома P450s^, относящегося к группе митохондриальных цитохромов Р450, в настоящей работе осуществлено последовательное удаление С-концевых аминокислотных остатков гемопротеида и оценена их роль в фолдинге и катализе. Отмечено, что удаление 1-9 аминокислотных остатков (А9-цито-хром P450scc) значительно не сказывается на физико-химических свойствах транкированных форм цитохрома P450scc, но сопровождается резким увеличением экспрессии рекомбинантного гемопротеида (А4-цитохром P450scc) в Escherichia coli. Удаление же 10 С-концевых аминокислотных остатков (А10-цитохром P450scc) зрелой формы цитохрома P450scc (замена кодона Arg472 на стоп-кодон) сопровождается потерей им способности правильно собираться в клетках бактерий E. coli. На основании полученных данных сделан вывод, что С-концевые аминокислотные остатки цитохрома P450scc (AArg472-Ala481) играют важную роль в правильной сборке рекомбинантного белка и необходимы для связывания гема при экспрессии цитохрома P450scc в E. coli, а фолдинг митохондриального цитохрома P450scc при его гетерологической экспрессии в бактериальных клетках схож с фолдингом растворимых гемопротеидов прокариот, а не микросомальных цитохромов Р450 эукариот.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цитохром P450scc, сайт-направленный мутагенез, гетерологическая экспрессия, белок-белковые взаимодействия.
Цитохром Р450 представляет собой обширное суперсемейство гемопротеидов, которые обнаружены практически во всех организмах. Цитохром Р450 катализирует многочисленные реакции биосинтеза и трансформации различных физиологически важных липофильных соединений, таких как стероиды, жирные кислоты, гормоны, ксенобиотики, включая лекарства, пищевые добавки и поллютанты [1]. Несмотря на широкое разнообразие, все цитохромы Р450 эукариот в зависимости от состава электрон-транспортной цепи и местонахождения можно разделить на две основные группы: микросомальные цитохромы Р450 (расположены в основном в мембранах эндо-плазматического ретикулума) и митохондриаль-ные цитохромы Р450 (расположены во внутренней мембране митохондрий) [2].
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 06-095, 16.07.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
Цитохром Р450 играет значительную роль в биосинтезе стероидов [3, 4]. Холестерингидро-ксилирующий цитохром Р450 — цитохром Р4508СС (СУР11А1) - экспрессируется преимущественно в стероидогенных тканях и является терминальной оксидазой холестерингидрокси-лирующей системы, которая участвует в трансформации холестерина в прегненолон (основной предшественник всех стероидных гормонов) [5]. В процессе трансформации холестерин участвует в трех последовательных реакциях гидроксилирования, приводящих к образованию 22-гидроксихолестерина, 20,22-дигидрок-сихолестерина и прегненолона. Эти реакции определяют скорость биосинтеза стероидных гормонов и находятся под контролем ряда регу-ляторных механизмов [6].
Цитохром Р450-зависимая стерол-14а-деме-тилаза (СУР51) — важнейший фермент биосинтеза стеролов у эукариот и прокариот [7]. Цитохром Р450-зависимая стерол-14а-деметилаза катализирует реакцию окислительной элимина-
ции 14а-метильной группы ланостерина и 24-метилен-24,25-дигидроланостерина у дрожжей и грибов, обтусифолиола у растений и 24,25-ди-гидроланостерина у животных с образованием Д14,15-ненасыщенного промежуточного продукта на пути биосинтеза — эргостерина (грибы), фи-тостерина (растения) и холестерина (животные). В процессе превращения субстрат участвует в трех последовательных монооксигеназ-ных реакциях, приводящих к образованию 14-гидроксиметил- и 14-формил-производных с последующим удалением муравьиной кислоты и образованием ненасыщенной двойной связи у углеродных атомов 14 и15 [8]. Тот факт, что сте-рол-14а-деметилаза выполняет одинаковую каталитическую функцию во всех биологических царствах, послужил основой для гипотезы о том, что этот фермент эволюционировал в поздней прокариотической эре (после появления молекулярного кислорода в атмосфере) и был предшественником всех эукариотических цитохро-мов Р450.
Сравнение аминокислотных последовательностей стерол-14а-деметилаз из различных источников, таких как млекопитающие, растения, грибы и бактерии, свидетельствует о высокой консервативности остатка аргинина Arg448 ци-тохрома Р450 из M. tuberculosis в С-концевых последовательностях других представителей этого подсемейства цитохрома Р450. Удаление консервативного положительного заряда в С-концевой последовательности полностью лишает водорастворимый цитохром P450 из M. tuberculosis (MTCYP51) способности экспрессиро-ваться в клетках Escherichia coli и правильно собираться. Вместе с тем удаление этого консервативного положительного заряда в С-концевой последовательности микросомальных эукарио-тических гомологов — цитохрома Р450 человека и С. albicans CYP51 — значительно не сказывается на уровне гетерологической экспрессии этих гемопротеидов и их фолдинге [9].
Как следует из пространственной структуры цитохрома P450 из M. tuberculosis [10], положительно заряженная группа остатка аргинина Arg448 располагается в непосредственной близости от отрицательно заряженной карбоксильной группы остатка аспарагиновой кислоты Asp287 (С-концевая часть а-спирали J), тогда как остальная часть атомов боковой цепи этого остатка находится в непосредственной близости от р-складки 3 (остатки 412—415). Результаты сравнения аминокислотных последовательностей митохондриальных цитохромов Р450 подсемейства CYP11 с С-концевой последовательностью CYP51 из M. tuberculosis указывают на то, что остаток Arg488 СУР51 соответствует остатку
Arg472 цитохрома P450scc, относительно консервативного среди подсемейства.
Цель настоящей работы — выяснение функциональной значимости С-концевой последовательности цитохрома P450scc в процессе фол-динга и связывания гемовой группы при его гете-рологической экспрессии в E. coli с помощью последовательного удаления концевых аминокислотных остатков гемопротеида. Результаты, представленные в настоящей работе, убедительно свидетельствуют о функциональной значимости С-концевых аминокислотных остатков хо-лестерингидроксилирующего цитохрома P450scc (ÀArg472—Ala481) в правильной сборке рекомби-нантного гемопротеида и связывании гема ци-тохрома P450scc при его экспрессии в E. coli.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали изопропил-1-тио^-D-галактопиранозид (ИПТГ) («Gibco BRL», США), дрожжевой экстракт, пептон, триптон («Difco», США), холестерин, прегненолон, хо-лат натрия, Tween-20, кумасси G-250, глюкозо-6-фосфат, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, по-лиэтиленгликоль (6 кДа), Hepes («Serva», Германия), ^фарозу-4В, BrCN-активированную ^фарозу-4В, ДЭАЭ^ефарозу 6В («Pharmacia», Швеция), S-аминолевулиновую кислоту, фенил-метилсульфонилфторид (ПМСФ), NADP(H+) («Sigma», США), TSK-gel HW-50 («Toyopearl», Япония), Bio-Gel HTP («Bio-Rad», США).
Сайт-направленный мутагенез цитохрома P450scc. Делеции осуществлялись путем замены соответствующих кодонов С-концевых аминокислот стоп-кодонами с использованием следующих обратных праймеров, содержащих сайт для рестриктазы PstI или Sph1:
SCC-2 GTTCTGCAGCTAGGGCGGGTCCTG-GTTG,
SCC-4 GTTCTGCAGCTAGTCCTGGTTGAAG-GGGCGGAAG,
SCC-7 GAACTGCAGCTAAAAGGGGCGGAA-GACAAGG,
SCC-9 GAACTGCAGCTAGCGGAAGACAAG-GAAG,
SCC-10 TGCATGCAGTCAGAAGACAAGGAA-GAT
Для амплификации фрагмента кДНК цитохрома P450scc использовался прямой 5'-праймер:
GCCTCCTGAAAAGTGAGCAGATGCTCTTG-GAGGATG.
Амплификацию фрагмента кДНК цитохро-ма P450scc с указанными праймерами проводили так же, как описано в работе [11]. После проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) продукты амплификации и исходный вектор, содержавший кДНК зрелой формы цитохрома P450scc быка, обрабатывались рестриктазой PstI. Затем проводилась замена исходного фрагмента кДНК цитохрома P450scc дикого типа на амплифицированный фрагмент, содержащий стоп-кодон в соответствующем положении. Плазмида pTrc99A, содержавшая кДНК зрелой формы цитохрома P450scc быка, была любезно предоставлена М. Ватерманом (Vanderbilt University, США).
Наличие нужной замены в цепи кДНК цитохрома P450scc контролировали рестрикцион-ным анализом и автоматическим секвенирова-нием на ДНК-секвенаторе А377 («Applied Biosystems», США).
Экспрессия и очистка белков. Плазмиды, содержавшие последовательности зрелого адрено-доксина (рВа1159) и адренодоксинредуктазы (pBAR 1607), были любезно предоставлены И. Сагара (Kochi Medical School, Япония). Экспрессия и очистка адренодоксина и адрено-доксинредуктазы проводились так же, как описано в работе [12].
Экспрессия и выделение из клеток E. coli транкированных форм и полноразмерного ци-тохрома P450scc осуществлялись по схеме получения связанной с субстратом высокоспиновой формы гемопротеида [13].
Аналитические методы. Анализ белкового состава бактериальных клеток после экспрессии и контроль чистоты полученных белковых препаратов осуществляли с помощью гель-электрофореза в 10%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na [14].
Для специфического окрашивания гелей на гем посредством пероксидазной реакции гель помещали в раствор ортофенилендиамина (15 мг ОРD на 10 мл 50 мМ натрий-фосфат-цитратно-го буфера, рН 5,0) на 30 мин при перемешивании в темноте при комнатной температуре. Затем добавляли перекись водорода до конечной концентрации 30 мМ. Окрашивание проявлялось начиная с 3 мин и развивалось в течение 20—25 мин. Гель быстро отмывали в 50
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.