УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2007, том 127, № 1, с. 58-72
УДК 612.112.91.014.46.08
РОЛЬ Са2+ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ НЕЙТРОФИЛОВ
© 2007 г. Ä. Ä. Галкин, В. С. Демидова
Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Москва
Обобщены литературные данные о роли ионов Са2+ в регуляции респираторного взрыва, секреторной дегрануляции, фагоцитоза и хемотаксиса нейтрофилов.
ВВЕДЕНИЕ
Нейтрофильные лейкоциты являются первым эшелоном защиты организма от инфекции, вызванной бактериями, грибами, вирусами, а также от трансформированных или поврежденных клеток организма-хозяина. Нейтрофилы - мульти-функциональные клетки, способные адгезиро-вать к стенкам капилляров и венул в участках воспаления, эмигрировать из кровяного русла в ткани, двигаться к патогену, фагоцитировать и уничтожать патоген, используя разнообразные цитотоксические механизмы.
При избытке в очаге воспаления или крови факторов активации запускается процесс неконтролируемого высвобождения в окружающую среду токсических кислородных радикалов и содержащихся в гранулах гидролитических ферментов. В настоящее время накоплен большой экспериментальный и клинический материал, позволяющий рассматривать активацию нейтрофилов в качестве чрезвычайной реакции, определяющей патологическое течение воспаления. Особую опасность представляет активация нейтрофилов в кровяном русле и вызванное этим повреждение сосудов микроциркуляции. Фагоцит-опосредуемую цитотоксичность считают причиной мультиорганных повреждений при обширных травмах, ожогах, сепсисе, операциях с реперфузи-ей органов и длительных операциях с применением аппаратов искусственного кровообращения.
В лабораторных условиях активацию нейтрофилов можно вызвать различными корпускулярными и растворимыми химическими агентами, например, трипептидом formyl-Meth-Leu-Phen (FMLP), фактором комплемента С5а, лейкотрие-ном В4 (ЦГВ4), фактором активации тромбоцитов (PAF), интерлейкинами 1 и 8 (^-1, ¿-8), кон-канавалином А (Соп-А), кальциевым ионофором А23187, форболовыми эфирами, агрегированными иммуноглобулинами и др.
Наиболее изучены в настоящее время эффекты, вызываемые действием на нейтрофилы бактериального трипептида FMLP, поэтому в обзоре основное внимание уделено этому стимулятору, также называемому формилпептидом.
Действие FMLP на нейтрофилы зависит от его концентрации и количества оккупируемых клеточных рецепторов. При увеличении концентрации FMLP функции нейтрофилов активируются в иерархической последовательности: хемотаксис от 10-11 М с пиком при 10-10 М и падает при более высоких концентрациях; фагоцитоз от 10-10 М с пиком 10-9 М и далее убывает; кислородный
взрыв с генерацией 02 Н2О2 и ОН от 10-8 М с пиком 10-6 М [49, 104].
Иерархия ответов нейтрофила в зависимости от процента оккупации рецепторов выглядит следующим образом: менее 0.1% оккупируемых рецепторов вызывает полимеризацию актина, 1% -Са2+-ответ, 1-3% - деполяризацию и цАМФ ответ, 3% - секрецию эластазы и дегрануляцию, 10% - секрецию супероксида, 30% - агрегацию нейтрофилов [124].
Хемотаксис требует небольшой оккупации рецепторов (0.5%) в течение длительного времени, активационные процессы - взрывной оккупации достаточно большого числа рецепторов (5%) [89]. Подобная дозозависимость функций нейтрофилов проявляется при действии другого хемоат-трактанта С5а фактора комплемента [43].
В отношении сродства к лигандам различают субпопуляции рецепторов, высокоаффинные рецепторы к FMLP, LTB4 инициируют хемотаксис, а низкоаффинные - дегрануляцию [39].
При взаимодействии агониста с рецептором сигнал передается на фосфолипазу С через активацию промежуточного гуанинового нуклеотидсвя-зывающего регуляторного G-белка, чувствительного к коклюшному токсину. Вследствие активации фосфолипазы С происходит быстрый гидролиз фосфоинозитидов, который в свою очередь приводит к образованию инозитол-трифосфата и диацил-глицерина, соединений, являющихся вторичными мессенджерами. Основной функцией инозитол-трифосфата (1ш(1,4,5)Р3) - является мобилизация Са2+ из внутриклеточных пулов. Диацилглицерин остается в плазматической мембране, действует как вторичный мессенджер, активируя протеин-киназу С. Ионы Са2+ осуществляют свои функ-
ции различными путями: либо стимулируют Са2+/кальмодулин-зависимую протеинкиназу, либо непосредственно активируют функционально важные ферменты, такие как диацилглицеролкиназа, фосфолипаза А2 и липооксигеназа. Протеинки-наза С начинает фосфорилировать специфические белки по сериновым и треониновым остаткам [4, 64].
Все виды активности нейтрофилов связаны с быстрой реорганизацией цитоскелета, при этом актин полимеризуется, поперечно сшивается, за-якоривается на мембране и деполимеризуется под контролем различных актин-связывающих белков. Са2+ действует как внутриклеточный сигнал к реорганизации цитоскелета, он ингибирует одни и активирует другие актин-связывающие белки и вызывает растворение подмембранного цитоскелета [54].
Са2+ регулирует также потоки ионов К+ и С1-через плазматическую мембрану, участвующие в регуляции объема и активации нейтрофилов [59].
СОСТОЯНИЕ СА2+ В ПОКОЯЩИХСЯ НЕЙТРОФИЛАХ
Кальций действует как универсальный вторичный посредник в различных типах клеток. Внутриклеточная концентрация свободного кальция строго контролируется различными регуля-торными механизмами, такими как кальциевые каналы, кальциевые помпы и кальциевые обмен-ники. Уровень свободного Са2+ в цитоплазме очень низок - в состоянии покоя он составляет около 10-7 М и его максимальный подъем при стимуляции не превышает 10-5 М [1].
В нейтрофилах основная часть внутриклеточного кальция находится в связанном состоянии в ядре, митохондриях и микросомальной фракции. Общая концентрация кальция в нейтрофиле по расчетам составляет 0.43 - 0.76 мМ, концентрация обмениваемого кальция - 3 х 10-5 М, а свободного Са2+ - от 10-7 до 10-6 М [94, 140]. Эти данные говорят о том, что незначительная часть обмениваемого кальция находится в слабо связанном состоянии и может присутствовать в цитоплазме клетки в виде свободных ионов Са2+. Свободный цитоплазматический Са2+ составляет крайне малую долю от всего внутриклеточного кальция и его колебания практически не отражаются на общем содержании кальция в клетке.
Концентрацию свободных ионов Са2+ в цитоплазме клеток принято обозначать [Са2+];.
Регистрация [Са2+] производится с помощью проникающих в клетку зондов, способных флуоресцировать при связывании ионов Са2+. Наибольшее применение нашли зонды Quin-2, 1Мо-1, Fura-2, F1uo-3, синтезированные на основе кальциевого хелатора 1,2-бис(о-аминофенокси)этан-
^^№\№-тетраацетат (БАФТА). С их помощью удается измерять не только усредненную величину [Са2+] в клеточных популяциях, но также регистрировать перемещения и осцилляции свободных ионов Са2+ в цитоплазме одиночных клеток при разнообразных воздействиях. Преимущества и недостатки зондов и техника измерений описаны ранее [1, 48].
РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМОЕ УВЕЛИЧЕНИЕ [Са2+]
При действии агонистов на нейтрофилы одним из наиболее ранних событий является транзиент-ное (преходящее) увеличение внутриклеточного Са2+. Амплитуда и длительность кальциевого ответа зависят от количества оккупируемых рецепторов и типа применяемого активатора.
Са2+-ответ на стимуляцию FMLP суспензии нейтрофилов, нагруженных зондами Quin-2 и Fura-2, имеет вид плавной кривой с острым подъемом и спадом в течение нескольких минут [92]. Лаг-период подъема [Са2+] составляет 1-3 с, что зависит от концентрации агониста и не зависит от экстраклеточного Са2+ [139]. Максимум [Са2+] в цитоплазме достигается через 15 с после начала стимуляции хемоаттрактантом [145].
Увеличение [Са2+] состоит из двух компонент: немедленной и не зависимой от экстраклеточного Са2+ и более поздней, которая устраняется удалением Са2+ из среды. Эти две компоненты отражают участие двух субклеточных структур в кальциевом гомеостазе: внутриклеточных Са2+-запасников, относимых к кальциосомам и плазматической мембраны. Функционирование внутриклеточных запасников Са2+ зависит от кальциевой помпы, функционально и иммунологически соответствующей Са2+-АТФазе сердечного сар-коплазматического ретикулума, Са2+-запасающе-го белка, подобного мышечному кальсеквестрину, и Са2+-высвобождающих каналов, чувствительных к инозитол 1,4,5-трифосфату. Са2+-регуляторная функция плазматической мембраны зависит от кальциевой помпы, подобной эритроцитарной Са2+-АТФазе и кальциевых каналов, тесно связанных с обменом фосфатидилинозитола [58].
Рецепторные антагонисты PAF и ингибиторы фосфолипазы А2 не влияют на быструю начальную фазу при стимуляции FMLP, но ингибируют медленную фазу подъема [Са2+]^ Двухфазный Са2+ -ответ на стимуляцию FMLP объясняется высвобождением эндогенного PAF и дополнительной аутостимуляцией нейтрофилов [123].
При стимуляции LTB4 длительность Са2+-от-вета короче [91]. Экзогенный ЦГВ4, в отличие от FMLP, не способен стимулировать синтез 5-эйко-затетраеновой кислоты (5-НЕТЕ) и ЦГВ4 из эндогенного арахидоната, высвобождать арахидо-
новую кислоту из липидов, стимулировать синтез PAF, он значительно слабее стимулирует секрецию и является неполным активатором нейтро-филов [101]. Антагонисты PAF и ингибиторы фосфолипазы А2 не влияют на изменения [Са2+]ь вызванные стимуляцией активатором ЦГВ4 [123].
Пептидный цитокин ^-8 вызывает более быстрый Са2+-ответ, чем FMLP [120]. IL-8 запускает те же сигнальные каскады, что FMLP, но, в отличие от FMLP, вызывает более умеренный метаболизм полифосфоинозитидов и отсутствие вторичного поступления Са2+ из экстраклеточной среды после мобилизации внутриклеточного Са2+ [85].
В работах, проведенных на одиночных клетках различных типов, показано, что изменения [Са2+] не являются плавными, а скорее напоминают периодические квантованные всплески, или осцилляции. В настоящее время принято считать, что кальциевые осцилляции являются универсальным способом изменения [Са2+] [1]. Частота осцилляций зависит от концентрации агонистов и при насыщающей концентрации агонистов изменение [Са2+] может напоминать плавную кривую, подобную той, что наблюдается в клеточных популяциях.
В нейтрофилах также обнар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.