ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 460, № 6, с. 729-732
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 591.3; 593.7
РОЛЬ ЩЕЛЕВЫХ КОНТАКТОВ И МЕХАНОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ИОННЫХ КАНАЛОВ В МЕХАНИЗМАХ ПУЛЬСАЦИОННОГО РОСТА ГИДРОИДНОГО ПОЛИПА вопогНутеа [оувт © 2015 г. Д. А. Никишин, С. В. Кремнёв, Н. С. Глаголева
Представлено академиком РАН С.А. Лукьяновым 28.08.2014 г. Поступило 28.08.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565215060286
Рост и морфогенез всех зачатков колониальных гидроидных полипов происходит в результате пульсаций специализированных апикальных участков колонии — верхушек роста. В основе пульсационного роста лежат периодические проксимо-дистальные волны сокращений и релаксаций клеток эпи- и гастродермы. В пределах верхушки отсутствует пролиферация, и рост осуществляется исключительно за счет клеточных движений [1]. Существует прямая зависимость между параметрами пульсаций в ходе нормального или экспериментально модифицированного верхушечного роста и формой будущего зачатка [2]. Исследование механизмов, лежащих в основе пульсационного роста гидроидных полипов, представляет интерес как простая контролируемая модель эпителиальных морфогенезов, которые широко представлены при развитии зачатков различных органов всех животных, в том числе и млекопитающих.
Механизмы пульсационного роста гидроидных полипов на клеточном уровне хорошо описаны в работах Белоусова [1—3] и Косевича [5]. В ходе роста верхушек гидроидов происходят последовательные ритмические движения клеток, приводящие к постепенному небольшому приросту после каждого цикла. При этом для эпидермы характерно периодическое изменение объема и ориентации клеток, происходящее путем осмо-контрактильного механизма. Увеличение объема клеток эпидермы происходит на стадии вытяжения в результате накопления и увеличения объема вакуолей, которые затем сливаются и изливаются во внешнюю среду, что приводит к уменьшению объема на стадии сокращения [6, 7]. В это же
Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова
E-mail: denisnikishin@gmail.com
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова
Российской Академии наук, Москва
время происходит проксимо-дистальное перемещение апикальных поверхностей эпидермальных клеток, что позволяет начать следующий цикл клеточных движений с новой точки. Косвенными методами показано, что фаза сокращения сопровождается деполяризацией клеточной мембраны и увеличением концентрации цитоплазматиче-ского кальция [2, 7]. В отличие от эпидермы клетки гастродермы всегда сильно вакуолизированы, и их движения не сопровождаются изменением объема. Гастродермальный компонент ростовой пульсации заключается в изменении формы гастро-дермальной трубки: сужение и удлинение, вероятно происходящее за счет сокращения кольцевых мышечных отростков эпителиально-мышечных клеток гастродермы, чередуются с ее утолщением и укорочением [5]. Таким образом, пульсационный рост происходит в результате согласованных движений клеток эпидермы и гастродермы, причем за счет гастродермы происходит проталкивание верхушки и растягивание молодого перисарка, а за счет движений эпидермальных клеток происходит фиксация прироста.
Неясным остается то, каким образом происходит координация клеточных движений в ходе пульсационного роста. Замечено, что изменения клеточной ориентации распространяются волнообразно в проксимо-дистальном направлении. Исключение составляют движения во время стадии укорочения, когда клетки начинают двигаться практически синхронно [6]. В пределах эпите-лиев клеточная коммуникация может происходить с помощью щелевых клеточных контактов за счет распространения деполяризации или сигнальных молекул. Белки щелевых контактов, ин-нексины, описаны у беспозвоночных, в том числе у кишечнополостных [8]. По всей вероятности, движения клеток во время пульсационного роста координируются с помощью щелевых контактов, что объясняет проксимо-дистальные волны клеточных движений. С другой стороны, движения
730
НИКИШИН и др.
Время, мин
Рис. 1. Кривые пульсационного роста верхушек столона О. Iоувт под действием блокатора щелевых контактов карбе-ноксолона (а) и блокатора механочувствительных ионных каналов иона гадолиния(Ш) (б).
клеток на стадии сокращения могут запускаться при активации механозависимых ионных каналов [1] подобно тому, как это происходит при направленном движении кератиноцитов [9].
В настоящей работе мы исследовали механизмы координации клеточных движений в ходе ростовых пульсаций гидроидных полипов, выбрав в качестве объекта верхушку столона как наиболее простую систему, не подверженную морфогенезу и удобную в методическом плане.
Исследование выполнено на Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова МГУ. Колонии Gonothyraea loveni Allman (1859) собирали на Еремеевском пороге (66°33'06.8'' с.ш. и 33°06'57.2'' в.д.). Фрагменты побегов, помещенных на предметные стекла, высаживали в аквариум с аэрацией и культивировали при комнатной температуре (20—22°С) и ежедневном кормлении
науплиусами артемии. Через 3 дня формировались молодые колонии, состоящие из материнского побега, столона и 1—2 новых побегов. Для эксперимента использовали активно растущие верхушки столонов без каких-либо аномалий. Регистрацию роста верхушек столонов проводили с помощью микроскопа МБИ-1 ("ЛОМО", СССР), цифровой окулярной насадки DCM-130 ("ScopeTek", КНР) и программы ScopePhoto ("ScopeTek"), которая каждые 5 с сохраняла изображение в формате JPEG. Автоматическую обработку изображений проводили с помощью оригинальной программы, разработанной в лаборатории биофизики развития Биологического факультета МГУ [10], которая извлекала координаты дистального конца верхушки роста из полученной последовательности изображений. В качестве действующих веществ использовали октанол-1 ("Sigma-Aldrich",
РОЛЬ ЩЕЛЕВЫХ КОНТАКТОВ
731
Контроль, стадия Контроль, стадия Гадолиний Карбеноксолон
вытяжения сокращения 50 мкМ 100 мкМ
Рис. 2. Микрофотографии срезов верхушек роста столона G. loveniв контроле на разных стадиях пульсационного роста и в эксперименте под действием блокатора щелевых контактов карбеноксолона и блокатора механочувствительных ионных каналов иона гадолиния(Ш).
США), двунатриевую соль карбеноксолона ("Sig-ma-Aldrich") и хлорид гадолиния(Ш) ("Sigma-Al-drich").
Для исследования роли щелевых контактов в клеточной коммуникации при пульсационном росте использовали два блокатора — октанол и карбеноксолон, эффективность которых показана на широком спектре объектов, в том числе на беспозвоночных [11]. Эффекты двух веществ были сходными. Инкубация колонии в присутствии как октанола, так и карбеноксолона приводит к замедлению роста верхушки. Этот эффект зависит от концентрации блокаторов щелевых контактов. Как октанол, так и карбеноксолон в концентрации 10 мкМ снижают скорость роста в два раза, а в концентрации 100 мкМ полностью останавливают рост. Действие обоих веществ проявляется не сразу, и для развития максимального эффекта требуется около 40 мин. После отмывки действующего вещества скорость роста постепенно восстанавливается (рис. 1а). Несмотря на то, что под воздействием блокаторов щелевых контактов рост верхушки угнетается, она продолжает периодически вытягиваться и сокращаться. Анализ параметров кривой роста показал, что период при этом остается неизменным, тогда как прироста во время пульсации не происходит (данные не представлены). На цейтрафферной видеозаписи эксперимента видно, что под воздействием блока-торов щелевых контактов клетки эпидермы перестают изменять ориентацию и исчезают периодические изменения рельефности поверхности верхушки, тогда как гастродерма продолжает периодически изменять форму. Это свидетельствует о том, что щелевые контакты играют существенную роль в координации движений клеток эпидермы. Гистологическое исследование экспериментальных верхушек роста показало, что под действием октанола и карбеноксолона клетки эпидермы приобретают вытянутую форму и косое положение относительно поверхности (рис. 2). Углы наклона эпидермальных клеток на стадиях
вытяжения и сокращения в экспериментальной группе не различаются и соответствуют значениям, наблюдаемым в контроле на стадии сокращения (рис. 3).
Таким образом, блок щелевых контактов препятствует переходу клеток эпидермы к стадии вытяжения, в результате чего они остаются сдутыми и ориентированными косо. Согласно осмокон-трактильной модели пульсационного роста, для обеспечения прироста необходимо периодическая смена стадий сокращения и вытяжения клеток эпидермы. При этом установлено, что переход к стадии вытяжения распространяется в верхушке роста в виде проксимо-дистальной волны [6, 7]. Можно полагать, что в пределах эпидермы по щелевым контактам распространяется сигнал, стимулирующий переход клеток к стадии вытя-
Угол наклона клеток эпидермы, град
Контроль Карбенок- Октанол Гадолиний солон
Рис. 3. Значения углов наклона клеток эпидермы верхушек роста столона G. loveni на разных стадиях пуль-сационного роста в контроле и в эксперименте под действием блокаторов щелевых контактов карбенок-солона и октанола и блокатора механочувствитель-ных ионных каналов иона гадолиния(Ш). M± m, * — p < 0.005 по критерию U Вилкоксона—Манна—Уитни при сравнении показателей стадий сокращения и вытяжения клеток в контрольной группе.
732
НИКИШИН и др.
жения. Вероятно, таким сигналом является деполяризация клеточной мембраны, на что указывают полученные ранее данные [2].
Для выявления роли механических факторов в регуляции осмоконтрактильного механизма пуль-сационного роста были проведены эксперименты с использованием иона гадолиния(Ш), который является специфическим блокатором механочув-ствительных ионных каналов [12]. Гадолиний полностью останавливал рост верхушки столона в концентрации 50 мкМ (рис. 1б). При этом, как и в случае блокады щелевых контактов, период пульсаций изменялся незначительно, а основной вклад в эффект гадолиния дает уменьшение прироста. Действие гадолиния проявляется моментально, но ограничено периодом около 40 мин, после чего происходит постепенное восстановление скорости роста. По всей вероятности, это связано с нестабильностью
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.