ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2013, том 63, № 2, с. 256-268
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ; ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 591.513.4+577.353.23
РОЛЬ СЕРИН/ТРЕОНИНОВЫХ И ТИРОЗИНОВЫХ ПРОТЕИНФОСФАТАЗ КОМАНДНЫХ НЕЙРОНОВ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ НА КЛЕТОЧНОМ АНАЛОГЕ ПРИВЫКАНИЯ
© 2013 г. А. С. Пивоваров1, Г. Б. Мурзина2, М. С. Третьякова1, Д. А. Махновский1
1Кафедра высшей нервной деятельности биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, Москва,
e-mail: as_pivovarov@mail.ru Поступила в редакцию 17.10.2011 г.
Принята в печать 24.05.2012 г.
Исследовано влияние ингибиторов ряда серин/треониновых фосфатаз: окадаевой кислоты (подавляет активность фосфатаз РР1 и РР2А), эндотала (PP2A), циклоспорина А и ципермет-рина (PP2B), ССТ007093 (PPM1D) и дефостатина (блокирует тирозиновые фосфатазы) на депрессию и спонтанное восстановление вызванного ацетилхолином входящего тока (АХ-тока) командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Все использованные ингибиторы изменяют динамику депрессии тока, а эндотал еще и замедляет спонтанное восстановление АХ-тока. Результаты исследования свидетельствуют о зависимости изменений холиночувствительности мембраны командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания от активности всех исследованных протеинфосфатаз. Применение математической модели, учитывающей возможность различных локализаций рецепторов в клетке, позволяет предположить участие указанных фосфатаз в мобильности (эндоцитозе и экзоцитозе) мембранных холинорецеп-торов, обеспечивающей изменение АХ-тока на клеточном аналоге привыкания. Из сравнения экспериментальных и полученных при моделировании расчетных кривых изменения АХ-тока следует, что основной мишенью протеинфосфатаз является транспортная система нейрона — цитоскелет и моторные белки.
Ключевые слова: окадаевая кислота, эндотал, циклоспорин А, циперметрин, CCT007093, дефостатин, изменение холиночувствительности сомы, командные нейроны, виноградная улитка, привыкание.
Role of Serine/Threonine and Tyrosine Protein Phosphatases in Command Helix lucorum Neurons at the Cellular Correlate of Habituation
А. S. Pivovarov, G. B. Murzina, M. S. Tretyakova, D. А. Makhnovsky
Department of Higher Nervous Activity, Biological Faculty, Moscow Lomonosov State University;
Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, Moscow, e-mail: as_pivovarov@mail.ru
Effects of some inhibitors of serine/threonine and tyrosine protein phosphatases on the depression and spontaneous recovery of the acetylcholine-induced inward current (ACh-current) in command Helix neurons of defensive behavior at the cellular correlate of habituation were investigated. The following drugs were used: okadaic acid (reduces activity of phosphatases PP1 and PP2A), endothall (PP2A), cy-closporine A and cypermethrin (PP2B), ССТ007093 (PPM1D), dephostatin (blocks tyrosine phosphatases). All used inhibitors modify the depression flow, and endothall reduces spontaneous recovery of ACh-current also. Obtained results indicate that changes in cholinosensitivity of command neurons depend on activity of all investigated protein phosphatases. Mathematical model considers the possibility of different localizations of receptors in a neuron and regularity of transitions between them. This
model makes it possible to conclude participation indicated phosphatases in mobility of membrane cholinoreceptors ensuring the ACh-current modification at the cellular correlate of habituations. Comparison of experimental and calculated curves of ACh-current change allows to conclude that the main target of protein phosphatases is the transport system of a neuron — cytoskeleton and motor proteins.
Keywords: okadaic acid, endothall, cyclosporin A, cypermethrin, CCT007093, changes in soma cholinosen-sitivity, command Helix lucorum neurons, habituation.
DOI: 10.7868/S0044467713020081
Изучая роль мобильности внесинаптиче-ских холинорецепторов (ХР) командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки в изменении межнейронной связи на клеточном аналоге привыкания обнаружено, что обратимое подавление чувствительности мембраны к ацетилхолину (АХ) вызывается снижением числа мембраносвязан-ных ХР в командных нейронах в результате изменения баланса внутриклеточных транспортных процессов в сторону преобладания интернализации ХР над их рециклированием. Этот молекулярный механизм реализуется с участием актиновых микрофиламентов и микротрубочек цитоскелета и включает активацию нескольких серин/треониновых протеинкиназ (ПК): ПКА, ПКG, Са2+/кальмодулин-зависи-мой ПК II (СаМКП), митогенактивируемой ПК (без участия ПКС), а также тирозиновых протеинкиназ, включая семейство Src-киназ
[1, 2, 4].
Основные воздействия исследованных ки-наз направлены на белки цитоскелета (акти-новые микрофиламенты и микротрубочки) нейронов. Фосфорилирование указанных белков приводит к полимеризации и стабилизации актиновых нитей, к стабилизации тубули-на — основного белка микротрубочек, к изменению активности моторных белков и, таким образом, к изменению скорости транспортных процессов, т.е. скорости эндоцитоза и экзоци-тоза рецепторов. Воздействие ПКG осуществляется (непрямым образом) на взаимодействие актина с миозином. ПКА, СаМКП и тирози-новая Src-киназа фосфорилируют также белки, активирующие перемещение ХР в клатри-новые ямки при эндоцитозе [1].
Химическая модификация белков в результате их фосфорилирования протеинкиназами представляет собой обратимый процесс благодаря отдельной группе ферментов — протеин-фосфатаз (ПФ), которые являются фосфо-трансферазами, поскольку катализируют процесс дефосфорилирования белка — перенос фосфатной группы с боковой цепи аминокис-
лоты белка в результате гидролиза сложно-эфирной связи фосфорной кислоты [15].
Среди внутриклеточных протеинфосфатаз выделено два больших класса: серин/треони-новые фосфатазы и тирозиновые фосфатазы, которые приводят к отщеплению фосфатной группы с аминокислотных остатков соответственно серина, треонина или тирозина. Се-рин/треониновые протеинфосфатазы включают до семи типов, среди которых в нервной системе наиболее представлены два — тип 1 (РР1) и тип 2 (РР2). В последнем в свою очередь выделяют два семейства по зависимости от ионов металлов — семейство ПФ, которое включает независимую от металлов протеин-фосфатазу РР2А и Са2+/кальмодулинстиму-лируемую протеинфосфатазу РР2В (кальци-нейрин), а также семейство РРМ, включающее Mg^-зависимую протеинфосфатазу РР2С [15]. Перечисленные протеинфосфата-зы составляют большую часть серин/треони-новых фосфатаз в клетках эукариот [5].
Фосфорилирование и дефосфорилирова-ние белка регулируют его функциональную активность. Преимущественно фосфорили-рование активирует белки, а дефосфорилиро-вание возвращает их обратно в состояние покоя. В то же время существует ряд белков, которые фосфорилированы в состоянии покоя, а в активное состояние переходят после процесса дефосфорилирования. В эукариотической клетке около 30% белков подвергаются фосфо-рилированию. Дефосфорилирование белков регулирует многие внутриклеточные процессы [5]. Так, дефосфорилирование мускариновых ХР вызывает их реактивацию, поскольку обнаружено, что ХР инактивируются вследствие их фосфорилирования при стимуляции агони-стом [9]. Ингибиторы тирозиновой протеин-фосфатазы вызывают накопление рециклиро-ванных никотиновых ХР в перисинаптиче-ской мембране нервно-мышечного синапса, что позволило предполагать роль дефосфо-рилирования тирозиновой протеинфосфата-зой во встраивании рециклированных ХР в
постсинаптическую мембрану и сохранении их числа [6]. Протеинфосфатазы РР1, РР2А, РР2В играют существенную роль в синапти-ческой пластичности [18].
Цель нашего исследования состояла в изучении роли основных серин/треониновых и тирозиновых фосфатаз в депрессии АХ-тока командных нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. В работе на морском моллюске аплизии (где были охарактеризованы свойства нейронных проте-инфосфатаз), как и в ткани позвоночных, за суммарную протеинфосфатазную активность отвечали только четыре фермента: PP1 (47%), PP2A (42%), PP2B (11%) и PP2C (менее 1%) [10]. Поэтому среди сериновых протеинфос-фатаз мы выбрали именно эти четыре: PP1, PP2A, PP2B, PP2CS/PPM1D/WIP1.
МЕТОДИКА
Экспериментальный объект. Эксперименты проведены на идентифицированных командных нейронах ЛПа2, ЛПа3, ППа3 и ППа2 оборонительного поведения виноградной улитки (Helix lucorum) на препарате изолированных ганглиев. Улитки были собраны в Крыму, в окрестностях Севастополя.
Препарат изолированных ганглиев. Предварительно животное анестезировали, охлаждая в течение 30 мин в смеси воды со льдом. Затем из тела улитки извлекали нервное окологлоточное кольцо ганглиев, которое фиксировали стальными микроиглами в проточной камере к подложке, изготовленной из полимерного материала силгард (Dow-Corning). Объем камеры составлял 1 мл, она была заполнена физиологическим раствором (мМ): NaCl — 100; KCl — 4; CaCl2 - 10; MgCl2 - 4; трис-НС1 - 10; pH 7.57.7. После обработки нервного окологлоточного кольца ганглиев ферментом, раствором дигестазы ("Seatec", Россия-Люксембург; 8 мг/1.2 мл, 20-70 мин при комнатной температуре) удаляли соединительнотканные оболочки, покрывающие ганглии.
Регистрация трансмембранных ионных токов. Для регистрации трансмембранных токов нейронов использовали методику двух-электр одной фиксации потенциала на мембране по схеме заземления объекта на "виртуальную землю". Для этого применяли микроэлектродный усилитель MEZ-8201 и усилитель фиксации потенциала CEZ-1100 (оба прибора фирмы "Nihon Kohden", Япония). Внутриклеточные электроды для двух-
электродной фиксации потенциала, изготовленные из стекла "пирекс" ("Harvard Apparatus", США), заполняли 2 М ацетатом калия (сопротивление электродов 4—113 МОм (30.97 ± 1.85
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.