МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 5, с. 756-785
= ДНК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
УДК 5771552
РОЛЬ СЛАБЫХ СПЕЦИФИЧЕСКИХ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В УЗНАВАНИИ И ПРЕВРАЩЕНИИ ФЕРМЕНТАМИ ПРОТЯЖЕННЫХ ДНК
© 2004 г. Г. А. Невинский*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090
Поступила в редакцию 23.10.2003 г.
Согласно современным представлениям, при поиске специфических последовательностей или различных сайтов узнавания (модифицированные звенья, разрывы, одноцепочечные участки ДНК и т.д.) ферменты "скользят" по ДНК с большой скоростью. Скольжение ферментов по ДНК возможно только в случае их достаточно высокого сродства к ДНК любой последовательности. Следовательно, не следует ожидать больших отличий в степени сродства ферментов к специфическим и неспецифическим последовательностям ДНК. Видимо, стадия комплексообразования фермента с ДНК не может быть основой специфичности их действия. Для выяснения факторов, обеспечивающих специфичность, мы проанализировали большое число ферментов репликации, репарации, то-поизомеризации, рестрикции, интеграции и рекомбинации с помощью различных физико-химических подходов, включая разработанный нами метод последовательного усложнения структуры ли-ганда. Показано, что высокое сродство любых ферментов к протяженным участкам ДНК обеспечивается возникновением большого числа слабых взаимодействий белка со всеми нуклео-тидными звеньями, "покрываемыми" белковыми глобулами. Основной вклад в эти взаимодействия вносят контакты положительно заряженных аминокислотных остатков ферментов с межнуклео-тидными фосфатными группами ДНК; при этом вклад каждого из таких контактов мал, и они реализуются, в основном, по типу взаимодействий между противоположно заряженными поверхностями биополимеров. В некоторых случаях заметный вклад в сродство также вносят слабые гидрофобные и/или ван-дер-ваальсовы взаимодействия ферментов с основаниями. В целом, в зависимости от фермента, такие слабые неспецифические взаимодействия обеспечивают от 5 до 8 порядков сродства ферментов к ДНК. Специфические взаимодействия ферментов с протяженными участками ДНК, в отличие от контактов ферментов с низкомолекулярными лигандами, обычно очень слабы и сопоставимы по эффективности со слабыми неспецифическими контактами. Чаще всего совокупность специфических взаимодействий обеспечивает около одного и редко около двух порядков сродства. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, после связывания ДНК с любыми из исследованных ферментов происходит адаптация структуры ДНК, включающая частичное или почти полное плавление ДНК, изменение структуры сахарофосфатного остова, растяжение, сжатие, образование изломов и изгибов, "выворачивание" оснований из тела ДНК и т. п., и совокупность такого рода изменений индивидуальна в случае каждого отдельного фермента. Исключительно важно, что все фермент-зависимые изменения структуры ДНК обеспечиваются не сильными, а слабыми специфическими контактами. Индивидуальные для каждого фермента изменения структуры ДНК необходимы для эффективной подгонки реагирующих орбиталей атомов фермента и ДНК с точностью до 10-15°, что возможно только в случае специфических ДНК. При переходе от неспецифических к специфическим лигандам происходит увеличение скорости реакции (кса1) на 4-8 порядков. Таким образом, стадии адаптации структуры ДНК и непосредственно катализа лежат в основе специфичности действия ферментов.
Ключевые слова: ДНК-зависимые ферменты, структура, механизмы действия.
Принятые сокращения: РСА - рентгеноструктурный анализ; оц-, дц— одно и двухцепочечный; АК - аминокислотный; ON - олигонуклеотид; АП - апурин/апиримидин; AP-EN - апурин-апиримидин эндонуклеаза; Fpg - 8-оксогуанин-ДНК-гли-козилаза; UDG - урацил-ДНК-гликозилаза, Topo - ДНК-топоизомераза I; IN - интеграза HIV; ссДНК - суперскрученная ДНК; НК - нуклеиновые кислоты, БН - белково-нуклеиновые.
* Эл. почта: Nevinsky@niboch.nsc.ru
THE ROLE OF WEAK SPECIFIC AND NONSPECIFIC INTERACTIONS IN RECOGNITION AND CONVERSATION BY ENZYMES OF LONG DNA, by G. A. Nevinsky*(Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division of RAS, Novosibirsk, 630090; *E-mail: Nevinsky@niboch.nsc.ru). According to a currently accepted model, enzymes engage in high-rate sliding along DNA when searching for specific recognition sequences or structural elements (modified nucleotides, breaks, single-stranded dNa fragments, etc.). Such sliding requires these enzymes to possess sufficiently high affinity for DNA of any sequence. Thus, significant differences in the enzymes' affinity for specific and nonspecific DNA sequences cannot be expected, and formation of a complex between an enzyme and its target dNa unlikely contributes significantly in the enzyme specificity. To elucidate the factors providing the specificity we have analyzed many DNA replication, DNA repair, topoisomerization, integration, and recombination enzymes using a number of physicochemical methods, including a method of stepwise increase in ligand complexity developed in our laboratory. It was shown that high affinity of all studied enzymes for long DNA is provided by formation of many weak contacts of the enzymes with all nucleotide units covered by protein globules. Contacts of positively charged amino acid residues with internucleotide phosphate groups contribute most to such interactions; the contribution of each contact is very small and the full contact interface usually resembles interactions between oppositely charged biopolymer surfaces. In some cases significant contribution to the affinity is made through hydrophobic and/or van der Waals interactions of the enzymes with nucleobases. Overall, depending on the enzyme, such nonspecific interactions provide 5-8 orders of the enzyme affinity for DNA. Specific interactions of enzymes with long DNA, in contrast to contacts of enzymes with small ligands, are usually weak and comparable in efficiency with weak nonspecific contacts. The sum of specific interactions most often provides approximately one and rarely two orders of the affinity. According to structural data, DNA binding to any of the investigated enzymes is followed by a stage of DNA conformation adjustment including partial or complete DNA melting, deformation of its backbone, stretching, compression, bending or kinking, eversion of nucle-otides from the DNA helix, etc. The full set of such changes is characteristic for each individual enzyme. The fact that all enzyme-dependent changes in DNA are effected through weak specific rather than strong interactions is very important. Enzyme-specific changes in DNA conformation are required for effective adjustment of reacting orbitals with accuracy about 10-15°, which is possible only for specific DNA. A transition from nonspecific to specific DNA leads to an increase in the reaction rate (kcat) by 4-8 orders of magnitude. Thus, the stages of DNA conformation adjustment and catalysis proper provide the high specificity of enzyme action.
ВВЕДЕНИЕ
Одним из наиболее информативных методов анализа ферментов в настоящее время является рентгеноструктурный анализ (РСА), позволяющий получать данные о белково-нуклеиновых (БН) взаимодействиях на молекулярном уровне [1-23]. Однако этот подход не дает количественных оценок относительной эффективности выявляемых с его помощью контактов, что исключает возможность оценки относительного вклада отдельных специфических и неспецифических контактов в общее сродство нуклеиновых кислот (НК) к ферментам [1-3]. В результате этого, на основании данных РСА комплексов ферментов с НК к настоящему времени сложились, по-видимому, ошибочные представления о том, что специфические контакты ферментов с НК (типа псевдо-уотсон-криковских взаимодействий [1-23]) могут обеспечить их высокое сродство к определенным последовательностям и, как следствие, специфичность действия ферментов. Кроме того, РСА дает информацию о комплексах ферментов с НК в кристаллическом состоянии, в то время как структуры комплексов фермент-НК в кристалле и в растворе могут существенно различаться, поскольку такие комплексы в кристалле в определенной степени "заморожены", а в растворе -более динамичны.
При исследовании ферментов широко используют сравнение субстратных свойств различных по структуре олигонуклеотидов (ОК) и их аналогов ([1-3] и ссылки в них). Однако при этом отсутствие субстратных свойств ОК иногда объясняют
тем, что они не имеют сродства к ферменту; однако это не всегда так, и они могут иметь сравнимое или даже более высокое сродство, чем оптимальные субстраты, но при этом не подвергаться превращению. Такие исследования качественного характера приводят к тому, что неправомерно завышается значимость стадии комплексообразова-ния в специфичности действия ферментов. Сравнительно редко применяемый для исследования ДНК-зависимых ферментов метод ингибиторного анализа является высоко информативным, особенно в случае целенаправленного систематического изучения анализируемого фермента. Возможности и недостатки некоторых других методов типа сайт-направленного мутагенеза и т.д. рассмотрены ранее в работах [1-3].
В целом, в литературе не описаны какие-либо количественные подходы к изучению НК-зависи-мых ферментов, которые по своей информативности могли бы быть сравнимыми с РСА. В то же время, количественная оценка наиболее важных факторов, имеющих первостепенное значение при узнавании ДНК различными ферментами, с нашей точки зрения, имеет принципиальное значение для понимания общих физико-химических закономерностей БН-взаимодействий. Без таких оценок имеются определенные пробелы в исследовании НК-зависимых ферментов и бытуют некоторые представления, которые, с нашей точки зрения, ошибочны. Так, принято считать, что ферменты, узнающие специфические НК, не способны эффективно связывать мононуклеотиды, короткие или длинные оцОК
В литературе опубликовано немного данных по количественной оценке относительных вкладов термодинамической (комплексообразов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.