научная статья по теме РОЛЬ СНИЖЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ В АКТИВАЦИИ Т-КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Химия

Текст научной статьи на тему «РОЛЬ СНИЖЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ В АКТИВАЦИИ Т-КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 4, с. 432-442

УДК 577.352

РОЛЬ СНИЖЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ В АКТИВАЦИИ Т-КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

© 2015 г. И. С. Литвинов*, И. В. Мерсиянова

ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 17.09.2014 г. Принята к печати 06.02.2015 г.

Кальций играет фундаментальную роль во многих жизненно важных функциях организма. Множество самых разнообразных инфекций способны приводить в той или иной мере к снижению концентрации ионов внеклеточного кальция ([Ca2+]o) (гипокальциемии) в крови больных. Важность Ca2+ в процессах активации Т-лимфоцитов давно известна, но оптимальные интервалы значений [Ca2+]o до сих пор не определены. Основной целью данной работы является изучение функциональной активности CD4+ Т-клеток в периферической крови человека (ПКЧ) in vitro в условиях гипо-кальциемии. В цельной крови здоровых доноров индукцию поликлональной активации проводили с помощью иммобилизированных моноклональных антител (мАт) к молекулам CD3 (epsilon цепь Т-клеточного рецептора) и растворенных мАт к CD28 (основная молекула костимуляции Т-кле-ток). Были исследованы зависимости параметров активации Т-клеток от величины [Ca2+]o в ПКЧ in vitro. Продукция интерлейкинов IL-2, -4, -17А, IFN-y и TNF-a, а также соответствующие доли CD4+CD69+, ОТ4+(ЦИТОКИН)+ и CD4+CD25+ Т-клеток были использованы в качестве параметров поликлональной активации Т-клеток в ПКЧ. Для снижения величины [Ca2+]o в ПКЧ использовали EGTA. Согласно полученным данным, связывание ионов внеклеточного кальция с помощью EGTA приводит к нелинейным зависимостям параметров активации Т-клеток от величины [Ca2+]o в ПКЧ. Добавление 10 мМ EGTA к покоящимся клеткам не влияло на исследованные параметры активации. Зависимость параметров активации Т-клеток от величины [Ca2+]o в ПКЧ представляет собой кривую с двумя максимумами и локальным минимумом между ними. Один из максимумов расположен в районе нижней границы нормы по [Ca2+]o в ПКЧ, другой — смещен в область более низких значений [Ca2+]o, характерных для патологических состояний. В тех же условиях активации в ПКЧ in vitro проанализирована продукция Т-клетками IL -2, -4, -17А, IFN-y и TNF-a, а также соответствующих долей CD4+(ЦИТОКИН)+ и CD4+CD25+ Т-клеток. Все полученные зависимости близки по форме с зависимостью изменения доли активированных CD4+CD69+ Т-клеток в ПКЧ in vitro от значений [EGTA] и представляют собой кривые с двумя максимумами. Полученные закономерности описаны впервые. Скорее всего, наличие двух максимумов и локального минимума между ними для параметров зависимости активации Т-клеток в ПКЧ от величины [Ca2+]o имеет важное физиологическое значение, так как гипокальциемия описана для многих патологий.

Ключевые слова: периферическая кровь человека, активация CD4+ Т-клеток, EGTA, концентрация внеклеточного кальция, цитокины, иммуноферментный анализ, проточная цитофлуориметрия.

DOI: 10.7868/S0132342315040090

ВВЕДЕНИЕ

Концентрация ионов кальция ([Са2+]0) в периферической крови человека (ПКЧ) давно рассматривается в качестве важного физиологического показателя [1]. Для данного параметра в сы-

Сокращения: ВМ80 — диметилсульфоксид, БОТА — эти-ленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-Лг,^,^',^'-тет-рауксусная кислота; 1Ь — интерлейкин; 1РЫ — интерферон; ТЫ, ТИ2 и ТЫ7 — СВ4+ Т-клетки-хелперы типов 1, 2 и 17; ТЫР-а - а-фактор некроза опухолей; мАт — монокло-нальные антитела; ПКЧ — периферическая кровь человека; ФСБ — фосфатно-солевой буфер.

#Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-72-65, эл. почта: catlismar@gmail.com).

воротке крови определены верхняя и нижняя границы нормы (1.38 и 0.93 мМ соответственно). Длительное отклонение от этих значений считается признаком патологии [2, 3]. Общий сепсис [4-6], СПИД [7], туберкулез [8], малярия [9] и другие инфекции зачастую приводят к выраженной гипокальциемии крови [10].

Целью представленной работы является анализ влияния снижения [Ca2+]o на поликлональную активацию CD4+ Т-клеток в составе ПКЧ in vitro. Выбор цельной крови в качестве объекта исследования не является случайным. Активация Т-клеток in vivo происходит в микроокружении, которое в

реальных условиях эксперимента вряд ли возможно смоделировать. Если даже присутствие эритроцитов меняет интенсивность ответа Т-лимфоцитов на мАт к a-CD3 [11], то участие других типов клеток крови в этом ответе трудно поддается сколько-нибудь достоверному описанию.

Величина [Ca2+]o в крови даже здоровых доноров зачастую имеет разное значение. Поэтому все эксперименты проводили по следующему протоколу. В крови каждого донора определялась величина [Ca2+]o и ее значение доводилось добавлением концентрированных растворов CaCl2 или EGTA до величины, максимально приближенной к 1 мМ. Снижение [Ca2+]o осуществлялось добавлением EGTA. Полученные препараты крови активировали смесью мАт к a-CD3 и a-CD28 и анализировали параметры активации CD4+ Т-клеток. Все полученные значения параметров активации CD4+ Т-кле-ток при различных концентрациях EGTA нормировали на их величины, полученные для цельной крови того же донора при значениях [Ca2+], близких к 1.0 мМ. Применение этого методического подхода позволяет значительно снизить величину разброса результатов даже между здоровыми донорами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Концентрация ионов внеклеточного кальция в крови здоровых доноров

В гепаринизированной крови здоровых доноров величина [Ca2+]o колебалась между значениями 1.05—0.89 мМ и всегда была ниже описанных для сыворотки крови величин [12, 13]. Это объясняется способностью гепарина связывать Ca2+ [14-16].

В представленной работе в качестве меры ги-покальциемии используется величина концентрации [EGTA], а не абсолютные значения [Ca2+]o. Ниже приведены аргументы в пользу этого выбора.

Во-первых, IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) [17] для корректного определения величины [Ca2+]o в ПКЧ давно были разработаны достаточно жесткие рекомендации. Согласно им, измерение величины [Ca2+]o проводится в контролируемых условиях: анаэробиоз или максимально возможная гипоксия, постоянная

концентрация ионов НС O- в плазме крови или постоянное парциальное давление СО2 в пробе, неизменные значения рН (лучше всего в интервале от 7.0 до 7.5) и температуры образца. В то же время измеренные при комнатной температуре в течение получаса после забора крови величины [Ca2+]o признаются достаточно корректными.

Именно в течение этого времени в представленной работе и проводили измерения величины [Ca2+]o с нужными концентрациями добавленного EGTA. Следовательно, на этот момент величина [Ca2+]o и добавленного EGTA находятся в достаточно хорошем соответствии между собой.

Во-вторых, для хранения образцов в течение нескольких часов правила IFCC накладывают дополнительные ограничения, в основном связанные с анаэробиозом, постоянством значении рН и пониженной температурой [17]. Эти параметры хранения образцов крови кардинально отличаются от общепринятых оптимальных условий культивации клеток человека: влажная атмосфера с 5% СО2, наличие кислорода и температура 37°С. Кроме того, длительная инкубация in vitro даже покоящихся клеток в оптимальных условиях их культивации всегда приводит к изменениям в плазме крови величины рН, концентрации ионов

HCO- и состава различной природы метаболитов клеток, в том числе и способных связывать ионы кальция [18—20]. Таким образом, измеренная в крови здорового человека в начале эксперимента (in vivo) величина [Ca2+]o в оптимальных условиях культивации клеток in vitro и при отсутствии каких-либо активирующих стимулов не остается неизменной даже в течение нескольких часов. Корректно провести измерение величины [Ca2+]o, согласно рекомендациям IFCC, в этом случае вряд ли представляется возможным.

В-третьих, в ходе поликлональной активации Т-клеток в ПКЧ in vitro интенсивность и направление многих биохимических реакции в клетках меняются и приводят к значительным изменениям

рН, концентрации ионов HCO- и концентрации продуктов метаболизма в плазме крови. Все эти факторы влияют на величину [Ca2+]o в ПКЧ in vitro. В зависимости от доли активированных Т-клеток отклонение величины [Ca2+]o от значения, определенного для покоящихся клеток крови того же донора, становится еще более неопределенным. К сожалению, никаких экспериментальных данных об изменениях величины [Ca2+]o в ходе поликлональной активации Т-клеток в ПКЧ даже здоровых доноров in vitro авторам найти не удалось. Скорее всего, данная проблема до сих пор не привлекала к себе внимания исследователей. В то же время концентрация EGTA, добавленной в кровь in vitro перед стимуляцией Т-клеток, не может измениться в процессе активации и/или инкубации этих клеток. Поэтому значение [EGTA] в ПКЧ in vitro может быть более строго воспроизведено в любом эксперименте.

[EGTA], мМ

Рис. 1. Типичная кривая титрования гепаринизиро-ванной периферической крови человека возрастающими концентрациями EGTA.

Зависимость концентрации ионов кальция в свежей гепаринизированной крови здоровых доноров от концентрации добавленной EGTA in vitro (кривая титрования)

Отправной точкой для анализа всех полученных в работе результатов являлась форма кривой титрования свежей гепаринизированной ПКЧ возрастающими концентрациями EGTA (рис. 1). Для гепаринизированной ПКЧ эта зависимость получена впервые. По своей форме она соответствует хорошо известным кривым титрования EGTA сложных растворов, содержащих ионы кальция [21, 22]. Все зависимости влияния величины [EGTA] на исследованные в работе параметры поликлональной активации CD4+ Т-клеток в ПКЧ in vitro сравнивались по форме именно с ней. Совпадение по форме с этой кривой было наиболее предсказуемым результатом до начала работы, однако ни одна из полученных в работе закономерностей зависимости параметров поликлональной активации CD4+ Т-клеток в ПКЧ in vitro никогда не повторила ее форму.

Используемые в работе критерии активации CD4+ Т-клеток в ПКЧ in vitro

Фенотипическим критерием самы

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком