ш
УДК 577.152.342*1134
РОЛЬ а-СПИРАЛИЗОВАННЫХ ДОМЕНОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ АТР-ЗАВИСИМОЙ Lon-ПРОТЕАЗЫ ИЗ ESCHERICHIA COLI
© 2014 г. А. Г. Андрианова, А. М. Куджаев, О. В. Серова, Н. И. Дергоусова, Т. В. Ротанова#
ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10 Поступила в редакцию 19.05.2014 г. Принята к печати 22.05.2014 г.
Гомоолигомерные АТР-зависимые LonA-протеазы — бифункциональные ферменты, относящиеся к суперсемейству ААА+-белков. Их субъединицы сформированы пятью последовательно соединенными доменами: Ж-концевым (N), а-спирализованным (Н1(СС)), нуклеотидсвязывающим (NB), вторым а-спирализованным (Н) и протеолитическим (Р). Наличие "вставочного" Н1(СС)-домена определяет уникальность ^пА-протеаз среди ААА+-белков. На примере Lon-протеазы E. coli (Ес-Lon) исследована роль а-спирализованных доменов в функционировании ^пА-протеаз. Проведено сравнительное изучение свойств интактной Ес-Lon и ее мутантных форм Lon-R164A и Lon-R542A, несущих замены остатков аргинина, локализованных в сходных положениях в Н1(СС)- и Н-доменах. Показано, что Н-домен играет исключительную роль для реализации гидролиза АТР и для связывания ферментом белка-мишени. Н1(СС)-Домен не имеет определяющего значения для проявления каталитических свойств фермента, однако влияет на эффективность функционирования АТР-азного и пептидазно-го центров Lon-протеазы и участвует в поддержании стабильности фермента. Выдвинуто предположение об участии Н1(СС)-домена в формировании пространственной структуры LonA-протеаз и/или в образовании комплексов с ДНК.
Ключевые слова: ААА+-белки, АТР-зависимая Ьоп-протеаза, доменная организация, а-спирализованные домены, сайт-направленный мутагенез, Escherichia coli.
DOI: 10.7868/S0132342314060037
ВВЕДЕНИЕ
Семейство АТР-зависимых Ьоп-протеаз (КФ 3.4.21.53; МБЯОР8: клан 81, 816) является одним из ключевых компонентов системы контроля качества (СКК), обеспечивающей целостность и функциональность клеточных белков [1—4]. СКК объединяет молекулярные шапероны, представленные, в основном, белками теплового шока (Нзр) различных семейств [5, 6], и ряд селективных пептидгидролаз и протеолитических комплексов — протеасом [7, 8]. Пептидгидролазы СКК (или ААА+-протеазы) — это бифункциональные ферменты, протеолитические компоненты которых относятся к протеазам разных классов, а АТР-азные являются представителями суперсемейства шаперонов-дезагрегаз ШрЮО или ААА+-белков (АТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями [9, 10]). В процессе функционирования СКК ААА+-проте-
Сокращения: AMPPNP — аденозин-5'-(Р,у-имидо)три-фосфат; DTDP — 4,4'-дитиодипиридин; Nu — нуклеотид; РерТВЕ - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl. # Автор для связи (тел.: +7 (495) 335-42-22; факс: (495) 33571-03; эл. почта: tatyana.rotanova@ibch.ru).
азы осуществляют селективную деградацию клеточных регуляторных белков и, кроме того, освобождают клетки от дефектных, поврежденных и мутантных белков.
Гомоолигомерные Lon-протеазы принадлежат к редким представителям ААА+-белков, у которых АТР-азные модули, состоящие из нуклеотидсвязы-вающих (nucleotide binding, NB) и а-спирализованных (helical, Н) доменов, и протеолитические компоненты (Р-домены), представленные серин—ли-зиновыми эндопептидазами [11], последовательно расположены в единой полипептидной цепи. Семейство Lon подразделяется на подсемейства A и В, первое из которых объединяет цитоплазматические ферменты бактерий и митохондриальные протеазы эукариот, а второе — мембраносвязанные Lon-про-теазы архей. LonA- и LonB-протеазы различаются окружением каталитических остатков серина и лизина в Р-домене, а также общей архитектурой: LonA-последовательности содержат пролонгированные Ж-концевые области, а LonB - трансмембранные домены, внедренные внутрь ААА+-моду-лей [12].
Мотивы Уолкера A B
Ser679 Lys722
i-s2, R164A
si R-f s2, R542A 11 /
N HI(CC) ААА+-модуль P-домен
v___ ___;
Ж-концевая область
Рис. 1. Доменная организация LonA-протеазы Е. coli. Обозначения доменов: N — Л'-концевой; Н1(СС) — а-спирали-зованный с coiled-coil-областью; NB — нуклеотидсвязывающий; Н — а-спирализованный; Р — протеолитический. NB- и Н-домены формируют ААА+-модуль. Обозначения консервативных элементов: А и B — мотивы Уолкера, s1 и s2 — сенсорные остатки, i-s2 — потенциальный сенсорный остаток, R-f — остаток "аргининовый палец", Ser679 и Lys722 — каталитически активные остатки.
В наших предыдущих работах показано, что Ж-концевые области LonA-протеаз образованы двумя доменами — собственно Ж-концевым (N-до-мен) и вставочным а-спирализованным, который включает участок с coiled-coil (СС) конфор-мацией (helical inserted СС-containing domain, Н1(СС)-домен) [13, 14]. Таким образом, доменная организация индивидуальных субъединиц LonA-протеаз может быть представлена следующей схемой: N—HI(CC)—NB—H—P, где фрагмент NB—H формирует ААА+-модуль.
Нами обнаружено сходство между LonA-про-теазами и шаперонами семейства ClpB/Hsp104 [14]. Субъединицы последних сформированы Ж-конце-вым доменом и двумя ААА+-модулями, при этом H1-домен первого ААА+-модуля шаперонов включает фрагмент с СС-конформацией, именуемый М-доменом, что соответствует схеме: N—NB1—H1(M)—NB2—H2. Оказалось, что Ш(СС)-домен LonА-протеаз проявляет выраженное подобие с Н1(М)-доменом шаперонов. В то же время в структуре ферментов отсутствует нуклеоти-дсвязывающий домен, аналог NB1-домена шаперонов, и это обстоятельство обусловливает уникальность строения LonА-протеаз среди ААА+-бел-ков, которые обычно содержат либо один, либо два полноценных двухдоменных ААА+-модуля. Роль вставочного Н1(СС)-домена в функционировании LonA-протеаз и/или в поддержании их активной структуры до настоящего времени не исследована. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение вклада двух а-спирали-зованных доменов — "классического", Н, и вставочного, HI(CC), — в проявление энзиматиче-ских свойств LonA-протеаз на примере Lon-про-теазы из E. coli (далее — Ес-Lon).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
а-Спирализованные домены (Н), которые вместе с нуклеотидсвязывающими доменами (МВ) формируют АТР-азные модули, служат отличительной характеристикой структуры ААА+-белков [10, 15, 16]. Классические Н-домены образованы четырьмя а-спиралями и включают положительно заряженный консенсусный остаток "8еп8ог-2" (82), локализованный в Ж-концевой части третьей спирали. Этот остаток совместно с другими консервативными фрагментами МВ-до-мена, к которым относятся мотивы А и В Уолкера, а также остатки "8еп8ог-1" (81) и "аргининовый палец" (Я-1), участвует в формировании АТР-аз-ного центра ААА+-белка.
Схема доменной организации субъединицы Ес-Ьоп-протеазы, полипептидная цепь которой образована 784 а.о., представлена на рис. 1. Н-До-мен ААА+-модуля фермента включает остатки (491—579), где роль сенсорного остатка 82 выполняет Аг§542. Вставочный Н1(СС)-домен сформирован остатками (124—302), при этом, как и в Н-домене, в начале третьей спирали Н1(СС)-до-мена также локализован остаток аргинина — Аг§164 (1-82, рис. 1). С целью выявления роли а-спирализованных доменов Ес-Ьоп-протеазы в функционировании фермента осуществлена точечная замена остатков Аг§164 и Аг§542 на аланин и проведено исследование свойств полученных му-тантных форм в сравнении со свойствами интакт-ного фермента.
Для оптимизации схемы выделения Ес-Ьоп-протеазы и ее мутантных форм получена реком-бинантная форма фермента, содержащая гекса-гистидиновый фрагмент (в составе октапептида ЬЕИИИИИИ) на С-конце белка (С-И18-Ьоп), а на ее основе — мутанты, несущие замены по сен-
100 90 80
£ о о я <ч
IS
w
й 50 «
св Я
Л
4
в
5
о О
я н
о
70 60
40 30 20 10
ß-казеин:
С'
„V
V
V
0
Рис. 2. АТР-азная активность интактной C-His-Lon-протеазы и ее мутантных форм Lon-R164A и Lon-R542A. Условия эксперимента: 50 мМ Трис-НС1-буфер, pH 8.1; 0.15 М NaCl; 37°С; концентрации: 5 мМ АТР; 20 мМ MgCl2; 1 мг/мл Р-казеин; 1 мкМ фермент.
сорному остатку s2 и подобному ему остатку i-s2 (Lon-R542A и Lon-R164A, соответственно). C-His-Lon и мутантные формы Lon-R164A и Lon-R542A в препаративных количествах получены c помощью аффинной хроматографии на Ni-сефа-розе и гель-фильтрации на сефакриле S-400.
Активность АТР-азных центров мутантных форм Ес-Ьоп-протеазы
Известно, что гидролиз АТР нативной Ес-Lon-протеазой в отсутствие белкового субстрата (базовая АТР-азная активность) наблюдается в области рН 7.0—9.0 (с максимумом при рН 8.0—8.2). При этом скорость гидролиза АТР максимальна при эквимолярном содержании нуклеотида и ионов магния. Наличие свободных ионов Mg2+ вызывает эффект ингибирования АТР-азной активности фермента, который устраняется в присутствии белкового субстрата [17].
Показано, что в отношении гидролиза АТР C-His-Lon-протеаза и мутант Lon-R164A сохраняют свойства нативного фермента, однако АТР-азная активность Lon-R164A заметно понижена (рис. 2, где за 100% принята начальная скорость гидролиза АТР C-His-Lon-протеазой в присутствии белкового субстрата). В то же время мутантная форма Lon-R542A не проявляет АТР-азной активности в интервале рН 7.0—9.0 при любых соотношениях концентраций нуклеотида и ионов магния и в присутствии в среде как белкового (Р-казеин), так
и пептидного (меллитин) субстрата. Таким образом, следует констатировать, что Lon-R542A полностью утрачивает способность к гидролизу АТР.
Полученные результаты подтверждают участие сенсорного остатка s2 (R542 у Ес-Lon) в формировании АТР-азного центра у LonA-протеаз (как и у других представителей ААА+-белков) и согласуются с данными по утрате способности к гидролизу АТР мутантными формами АТР-зави-симых протеаз, также содержащими замены остатков s2: ClpXP из E. coli [18], HslUV из E. coli [19] и LonB из Thermoplasma acidophilum [20]. Значительное понижение АТР-азной активности мутанта Lon-R164A по сравнению с интактной C-His-Lon-протеазой может быть обусловлено нарушением корректной конформации фермента при замене остатка i-s2.
Активность пептидазных центров мутантных форм Ec-Lou-протеазы
Ранее в качестве инди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.