СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2014, том 28, № 4, с. 90-94
_ СОМАТОСЕНСОРНАЯ _
СИСТЕМА
УДК 612.84/88 + 591.88 + 57.085.23 + 66.085.1
РОЛЬ Src-КИНАЗЫ В РЕЦЕПЦИИ ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
© 2014 г. В. А. Пеннияйнен, И. Л. Ячнев, А. В. Кипенко1, Е. В. Лопатина1, Б. В. Крылов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии
им. И.П. Павлова РАН 199034 Санкт-Петербург, наб. Макарова, д.6 E-mail: krylov@infran.ru
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный медицинский исследовательский
центр имени им. В.А. Алмазова " МЗ РФ 197341 Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, д. 2
Поступила в редакцию 23.05.2014 г.
Низкоинтенсивное инфракрасное (ИК) излучение активирует трансдукторную функцию Na+, К+-АТФазы, что может являться основным молекулярным механизмом рецепции стимулов этой модальности. Этот механизм может быть также активирован и "эндогенными" концентрациями уабаина. Исследование роста нейритов сенсорных нейронов 10-12-дневных куриных эмбрионов было осуществлено с помощью органотипического культивирования и морфометрических методов. На фоне ингибитора Src-киназы РР2 (10 мкМ) низкоинтенсивное инфракрасное излучение (при плотности энергии 2-10-10 Дж/см2) не влияло на рост эксплантатов. Степень роста нейритов сенсорных нейронов в этом случае соответствовала значению индекса площади в контроле. Участие Src-киназы в регуляции механизма трансдуктор-опосредованной внутриклеточной сигнализации, запускаемой "эндогенным" уабаином, исследовали также в присутствии ингибитора Src-киназы РР2. Сочетанное воздействие гликозида (0.1 нМ) и РР2 устраняло блокирующее действие уабаина на рост нейритов сенсорных нейронов. Индекс площади эксплантатов не отличался от контрольных значений. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что Src-киназа участвует во внутриклеточных каскадных процессах сенсорных нейронов, которые трансдуктор-опосредованно запускаются низкоинтенсивным излучением СО2-лазера.
Ключевые слова: сенсорные нейроны, органотипическая культура ткани, Src-киназа, Na+, К+-АТФаза, инфракрасное излучение.
ВВЕДЕНИЕ
Инфракрасное (ИК) излучение, особенно низкоинтенсивное, не приводящее к нагреву облучаемого объекта, успешно используется для исследования его действия на биологические ткани. Такое излучение приводило к снижению частоты повторных ответов нейрона-рецептора растяжения ракообразных (Павленко и др., 1975). При этом было установлено, что Ка+, К+-АТФаза участвует в рецепции ИК-излучения холоднокровных животных. Более детальное выяснение механизмов рецепции ИК-излучения теплокровными животными удалось осуществить при исследовании мембраны сенсорного нейрона благодаря применению метода локальной фиксации потенциала. Оказалось, что воздействие низкоинтенсивного
излучения спектрального диапазона 1-50 мкм с максимумом интенсивности в области 10 мкм приводило к изменению возбудимости мембраны сенсорного нейрона вследствие снижения потен-циалочувствительности медленных натриевых каналов за счет уменьшения величины эффективного заряда их активационного воротного устройства. Было показано, что ключевую роль в этом процессе играет Ка+, К+-АТФаза (Плахова и др., 2003). Позднее удалось установить, что специфической мишенью для излучения среднего ИК-диа-пазона (длина волны 10.6 мкм) служит молекула АТФ, находящаяся в сайте ее гидролиза на молекуле К+-АТФазы ^аеИпеу е! а1., 2012). Здесь происходит гидролиз молекул АТФ, колебательно возбужденных за счет поглощенной энергии излучения. Энергия излучения, переданная молеку-
РОЛЬ Src-КИНАЗЫ В РЕЦЕПЦИИ ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
91
лой АТФ в процессе колебательно-колебательной релаксации Na+, К+-АТФазе, специфически запускает ее трансдукторную функцию (Yachnev et al., 2012). Продукт же гидролиза молекулы АТФ -молекула АДФ может являться субстратом для Src-киназы (Thomas, Brugge, 1997), вовлеченной в механизм передачи на геном трансдукторного сигнала от Na+, К+-АТФазы. С другой стороны, было показано, что Src-киназа и Na+, К+-АТФаза способны объединяться, формируя функциональный сигнальный комплекс (Zhang et al., 2006; Liang et al., 2007; Schoner, Scheiner-Bobis, 2007). При действии уабаина в эндогенных концентрациях, которые способны специфически запустить трансдукторную функцию Na+, К+-АТФазы (Lopatina et al., 2012), киназный домен Src-киназы, находящийся в связанном с Na+, К+-АТФазой состоянии, диссоциирует, что приводит к активации Src-киназы (Xie, Cai, 2003; Pierre, Xie, 2006; Liang et al., 2007). Таким образом, специфически запустить трансдукторную функцию Na+, К+-АТФазы можно как очень низкими "эндогенными" концентрациями уабаина, так и низкоинтенсивным ИК-излучением. Можно ожидать, что вторым белком, спряженным с Na+, К+-АТФазой и участвующим в рецепции ИК-излучения, служит Src-киназа. Проверке этой гипотезе посвящена настоящая работа.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для выяснения механизма действия ИК-из-лучения на рост нейритов сенсорных ганглиев использовали метод органотипической культуры ткани. Исследования проведены на 400 эксплантатах 10-12-дневных куриных эмбрионов, культивируемых в чашках Петри на подложках из коллагена в СО2-инкубаторе (Sanyo) в течение трех суток при 36.5 °С и 5% СО2. Питательная среда содержала 45% раствора Хенкса, 40% среды Игла с добавлением инсулина (0.5 ед./мл), глюкозы (0.6%), глютамина (2 мМ), гентомицина, 5% куриного эмбрионального экстракта и 10% феталь-ной сыворотки коровы (Lopatina et al., 2012). Контрольными служили эксплантаты, культивируемые только в условиях питательной среды. Источником излучения являлся волноводный СО2-лазер с длиной волны излучения 10.6 мкм. Во время облучения экспериментального эксплантата в чашке Петри отсутствовала питательная среда. Время экспозиции составило 3 мин. Описание оптической схемы, использовавшейся в данных опытах, приведено в нашей предыдущей работе (Lopatina et al., 2012). Необходимо отметить, что
до начала и во время действия излучения контролировали температуру окружающей среды, которая поддерживалась на постоянном уровне (22 оС). В части экспериментов в культураль-ную среду добавляли ингибитор Src-киназы РР2 ("Sigma", США) и уабаин ("Sigma", США). Для визуализации объектов использовали микроскоп "Axiostar Plus" ("Carl Zeiss", Германия). Полученные изображения анализировали программой ImageJ. Часть эксплантатов окрашивали витальным красителем акридиновым оранжевым и исследовали при помощи лазерного сканирующего микроскопа "LSM 710" ("Carl Zeiss", Германия). Работа выполнена на оборудовании ЦКП "Конфокальная микроскопия" Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Для количественной оценки роста эксплантатов применяли морфометриче-ский метод. Индекс площади (ИП) рассчитывали как отношение площади зоны роста эксплантата к исходной центральной площади, где находятся немигрирующие клетки. Контрольное значение ИП принимали за 100%. Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы STATISTICA 6.0 с использованием t-кри-терия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Через трое суток культивирования эмбриональной нервной ткани в контрольных и экспериментальных эксплантатах сенсорных ганглиев формируются две зоны: центральная, состоящая из немигрирующих дифференцирующихся ней-робластов, и периферическая, так называемая зона роста. В зоне роста эксплантатов сенсорных ганглиев преобладает рост нейритов (отростков нервных клеток), в меньшей степени мигрируют и пролиферируют фибробластоподобные клетки и глия. Индекс площади является чувствительным параметром, позволяющим точно оценивать степень внешнего воздействия на нервные клетки и позволяет проверять гипотезы о возможных молекулярных механизмах реагирования живой ткани на внешние стимулы. При добавлении в питательную среду ингибитора Src-киназы PP2 в концентрации 60 мкМ наблюдали достоверное ингибирование роста нейритов спинальных ганглиев на 50±5% (n = 24, р < 0.05) по отношению к контрольным значениям (n = 26). В концентрации 10 мкМ ингибитор РР2 на рост исследуемой ткани практически не влиял: ИП экспериментальных эксплантатов не отличался от контрольного значения (рис. 1). Его специфическое действие на процессы, запускаемые активацией трансдук-
92
ПЕННИЯЙНЕН и др.
ИП, % 120 -,
100-1 80 60 40200
,чччч.
Контроль
РР2 10 мкМ
РР2 60 мкМ
Рис. 1. Влияние ингибитора Бго-киназы РР2 на рост нейритов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов (трое суток культивирования).
По оси ординат - индекс площади эксплантатов (ИП, %).
*
- различия достоверны относительно контрольных эксплантатов, р < 0.05.
ИП, % 120-
100 80-| 60 40
20-
Рис. 2. Изменение индекса площади эксплантатов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов при воздействии уабаина (0.1 нМ) в присутствии ингибитора Бгс-киназы РР2 (10 мкМ) (трое суток культивирования). 1 - Контроль, 2 - Уабаин, 3 - РР2, 4 - Уабаин+РР2
По оси ординат - индекс площади эксплантатов (ИП, %).
*
- различия достоверны относительно контрольных эксплантатов, р < 0.05.
торной функции №+, К+-АТФазы, должно быть исследовано при сочетанном действии с теми агентами, которые включают процесс трансдук-ции. Согласно нашим данным, только низкие концентрации ("эндогенные") уабаина и низкоинтенсивное лазерное излучение могут специфически активировать трансдуктурную функцию ^орайпа ег а1., 2012).
При исследовании влияния селективного ингибитора №+, К+-АТФазы уабаина на рост нейритов сенсорных ганглиев в аналогичных экспериментальных условиях было обнаружено, что №+,
К+-АТФаза сенсорных нейронов принимает участие в регуляции роста нейритов благодаря активации не насосной, а ее трансдукторной функции ^орайпа ег а1., 2012). На рис. 2 показано, что уабаин в концентрации 0.1 нМ достоверно инги-бировал рост нейритов сенсорных нейронов. При этом ИП эксплантатов был ниже контрольных значений на 50±7% (п = 20, р < 0.05). Для того чтобы выяснить участие Бгс-киназы в регуляции трансдуктор-опосредованной внутриклеточной сигнализации, запускаемой уабаином, нами было исследовано действие гликозида на фоне ингибитора Бгс-киназы РР2. Инкубирование эксплантатов в питательно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.