РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 1, с. 48-54
— ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
РОЛЬ TOLL-ПОДОБНОГО РЕЦЕПТОРА 2 И CD14 В ИММУНОСУПРЕССИИ ПРИ ИЕРСИНИОЗЕ
© 2008 г. Н.А. Филиппова*/**, И.Г. Козлов**, J. Heesemann***,
A. Sing***
* ГОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия Росздрава»;
** ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава»,
Москва, Россия;
*** Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie, Ludwig-Maximilians-Universität München, München, Germany
Поступила: 10.01.08 г. Принята: 24.01.08 г.
Характерной особенностью патогенных штаммов Yersinia является экспрессия вирулентного V-антигена (LcrV). LcrV является секретируемым протеином, который участвует в транслокации вирулентных протеинов Yersinia внутрь клетки хозяина и способствует преодолению врожденной иммунологической защиты организма. Данная работа посвящена изучению иммуномодулирующего эффекта V-антигена Y. enterocolitica на клетки хозяина. Впервые было показано, что бактериальный, нелипидированный вирулентный рекомбинантный протеин LcrV (rLcrV) и синтетические пептиды, повторяющие отдельные фрагменты его последовательности, вызывают индукцию экспрессии ИЛ-10 вследствие активации в клетке рецепторного комплекса CD14/TLR2. В результате индукции ИЛ-10 происходит подавление выработки ФНОа. Вероятно, данный процесс, происходящий в клетке хозяина при воздействии на нее V-антигена, является механизмом, с помощью которого Y. enterocolitica удается уклоняться от врожденного иммунного ответа.
Ключевые слова: иммунитет, моноциты/макрофаги, бактериальные протеины, иммуно-супрессия
ВВЕДЕНИЕ
Патогенность возбудителя чумы Yersinia pestis и энтеропатогенных штаммов Yersinia enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis определяется наличием вирулентной плаз-миды pYV. Данная плазмида кодирует аппарат вирулентности иерсиний, который включает в себя систему секреции и транслокации протеинов III типа, обозначаемую как TTSS (type III translocation and secretion system), протеин адгезин YadA (Yersinia adhesin A), транслоцируемые внутрь клетки хозяина эффекторные протеины Yops (Yersinia outer membrane proteins) и белки, секретируемые во внеклеточное пространство [1]. Совместное
Адрес: 170000, Тверь, ул. Советская, 4. E-mail: natvard@mail.ru
воздействие различных Yops на клетку хозяина приводит к угнетению «кислородного взрыва» в макрофагах, индукции апоптоза и подавлению фагоцитоза.
Одним из главных факторов вирулентности Y. pestis является LcrV (V-антиген). Этот белок кодируется pYV и секретируется во внеклеточное пространство всеми тремя патогенными штаммами Yersinia. В механизме патогенности иерсиний LcrV выполняет несколько функций, в частности обладает иммуносупрессивным действием. A. Sing и др. было установлено, что V-антиген подавляет продукцию ФНОа и ИФНу in vitro и in vivo. На основании высокой устойчивости ИЛ-10(-/-) мышей к иерсиниозу авторами было высказано предположение, что иммуно-супрессия связана с индукцией выработки ИЛ-10 [2, 3]. Необходимо отметить, что до последнего времени не определены рецепторы врожденного иммунитета, при взаимодейст-
вии с которыми реализуется иммуносупрес-сивный эффект LcrV иерсиний в организме хозяина.
Целью настоящей работы было исследование способности LcrV Y. enterocoIitica вызывать иммуносупрессию в клетках хозяина вследствие активации рецепторного комплекса CD14/TLR2, а также выявление активного региона LcrV, ответственного за взаимодействие с рецепторами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Антитела. Блокирующие связывание ЛПС с CD14 анти-CDH мАт bIG-10 и неблокирующие видоспецифические анти-CDM мАт bIG 4 были получены от компании Biometec. Мо-ноклональные анти-CD14 антитела, ингиби-рующие связывание ЛПС — MEM-18 и не ин-гибирующие связывание ЛПС — MEM-15, были любезно предоставлены Dr. Vaclav Horejsi, Институт молекулярной генетики, Прага, Чешская Республика.
Рекомбинантный LcrV (rLcrV) был любезно предоставлен Anna M. Geiger, Институт гигиены и медицинской микробиологии им. М. Пет-тенкофера, Мюнхен, Германия.
Липополисахариды (ЛПС), выделенные из Yersinia, были любезно предоставлены C. Kirschning, Технический университет, Мюнхен, Германия.
Синтетические пептиды, повторяющие аминокислотную последовательность N^-конца LcrV (V1: aa2-39, V2: aa31-70, V3: aa60-98, V4: aa94-131) были получены от Dieter Palm, Институт физиологической химии I, Вюрцбург, Германия.
Плазмиды (векторы экспрессии). pELAM-1-luc (endothelial cell-leukocyte adhesion molecule-promoter), pCD14, pTLR1, pTLR2, pTLR4, RSV-ß-галактозидаза (Rous sarcoma virus-ß-galactosidase) были любезно предоставлены C. Kirschning, Технический университет, Мюнхен, Германия. pMD2 была получена от K. Miyake, Университет Токио, Япония.
Получение перитонеальных макрофагов мышей. Для получения перитонеальных макрофагов были использованы мыши линии C57BL/6, экспрессирующие и не экспресси-рующие CD14 и TLR2 и мыши линии SV129, экспрессирующие и с отсутствием экспрессии TLR2. Животным интраперитонеально был введен 1 мл 10% раствора пептона. Через три дня был получен перитонеальный клеточный экссудат. Для проведения опытов in vitro
клетки поддерживали культивированием в среде RPMI 1640, содержащей 2 mM L-глюта-мина, 10 mM Хепес-буфера, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина и 10% инактивированную ЭТС при 37 °С и 5% содержании СО2 в окружающем воздухе.
Культивирование клеточных линий. Клетки линии Mono Mac-6 были любезно предоставлены Dr. H.W.L. Ziegler-Heitbrock, Институт иммунологии, Мюнхен, Германия. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% ЭТС, 2 mM L-глютамина, незаменимых аминокислот, 1 mM пирувата натрия, 9 ug/мл коровьего инсулина, 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина. Для экспериментов использовали 3-суточные культуры; концентрация клеток составляла
2 х 105 клеток/мл.
Клон клеток HEK 293 (человеческие эмбриональные почечные клетки) культивировался в среде DMEM c добавлением 10% инактиви-рованной ЭТС. Для трансфекции клетки линии HEK 293 использовались в концентрации
3 х 105 клеток/мл.
Определение уровня цитокинов методом ELISA. Уровень человеческого ФНОа был измерен при помощи мышиных античеловеческих (мАТ1) антител и меченых биотином ан-ти-ФНОа антител (мАТ11) (BD PharMingen). Мышиный ИЛ-10 был изучен с помощью коммерческого набора (R&D systems) согласно рекомендациям производителя. Измерение выполнялось с помощью DuoSet ELISA Development kit.
Трансфекция. Клетки HEK 293 в концентрации 3 х 105 клеток/мл разносили в 6-луночный плейт и инкубировали при 37 °C, 5% CO2 в течение 12 часов. Трансфекцию клеток проводили методом кальциево-фосфатной преципитации. Клетки лизировали и измеряли активность люциферазы с использованием реагентов Promega Corp.
Выделение плазмиды. Для выделения высококачественной ДНК в высоких концентрациях (до 100 мкг) был использован Nucleo-bond AX100 Kit (Machery-Nagel). Принцип выделения ДНК основан на алкалиновом лизисе клеток, очищении нуклеиновых кислот на основе анионообменной хроматографии. Процедура выделения проводилась согласно инструкциям производителя.
С целью очистки ДНК от контаминирую-щих протеинов была применена экстракция фенолом. Для очищения препарата ДНК от контаминации солями или концентрирования препарата ДНК был использован метод
осаждения этанолом. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на основе метода спект-рофотометрии. Полученную ДНК амплифи-цировали с помощью ПЦР. ПЦР-продукт анализировали с помощью электрофореза в ага-розном геле.
Статистическая обработка результатов. При постановке всех экспериментов параллельно с опытными вели контрольные пробы. Все результаты выражали как значения среднего ± стандартное отклонение. Различие средних показателей считалось достоверным, если величина коэффициента достоверности соответствовала уровню значимости P <0 ,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Иммуномодулирующий эффект rLcrV на клетки хозяина вследствие экспрессии CD14
ЛПС бактерий активируют комплекс CD14/TLRs в клетке хозяина [4 — 6]. Нами была поставлена задача установить, взаимодействует ли V-антиген Y. enterocolitica с CD14 на клетках хозяина и связано ли это взаимодействие с индукцией синтеза ИЛ-10. Для реализации поставленной задачи были получены перитонеальные макрофаги мышей линии C57BL/6 с отсутствием экспрессии CD14 (CD14( — / — )) и мышей дикого типа, экспрес-сирующих данный маркер (CD14( + / + )). Макрофаги разносили в планшет и стимулировали рекомбинантным LcrV (rLcrV) в концентрации 5 мкг/мл. После окончания 2-часового культивирования супернатанты собирали и оценивали в них уровень ИЛ-10 с помощью ELISA.
Как показали полученные результаты, ин-тактные макрофаги, полученные из мышей обеих линий, практически не синтезировали ИЛ-10. При стимуляции rLcrV макрофаги мышей дикого типа скачкообразно усиливали продукцию цитокина. Концентрация ИЛ-10 в супернатантах этих клеток при стимуляции возрастала почти в 10 раз. Напротив, CD14( — / — ) макрофаги на присутствие в среде rLcrV не реагировали и уровень продукции ИЛ-10 практически не отличался от нестиму-лированного контроля (рис. 1). На основании этих данных можно сделать предположение об участии CD14 в rLcrV-индуцированной экспрессии ИЛ-10.
Подтверждением высказанного выше предположения явились результаты, полученные в экспериментах с клеточной линией Mono-Mac-6 и оценкой продукции ФНОа.
Клетки разносили в планшет и прекультиви-ровали 13 часов. За 1 час до конца прекульти-вирования в опытные лунки добавляли блокирующие связывание ЛПС с CD14 анти-CD14 мАт (bIG-10 или MEM-18) в концентрации 10 мкг/мл. В качестве контроля использовали культуры без добавления антител или с добавлением неблокирующих видоспеци-фических анти-CD14 мАт (bIG-4 и MEM-15) в той же концентрации, что в опытных культурах. Через 13 часов прекультивирования в лунки добавляли 5 мкг/мл rLcrV или 1 нг/мл липополисахаридов на 6 часов. Затем проводили стимуляцию макрофагов 1 мг/мл зимо-зана А и через 12 часов в супернатантах определяли уровень секреции ФНОа методом ELISA.
Как видно из данных, представленных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.