УДК 612.115;577.1;577.2
РОЛЬ ТРАНСГЛУТАМИНАЗ В РЕГУЛИРОВАНИИ ФОРМИРОВАНИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИН-ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ СУБПОПУЛЯЦИИ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ ИХ АКТИВАЦИИ
© 2015 г. Я. Н. Котова1,2*, А. А. Абаева1, В. Н. Колядко1, А. О. Якименко2, Ф. И. Атауллаханов1,2,3,4, М. А. Пантелеев1,2,3,4
Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, 119991, Москва, Ленинский просп., 38А, корп. 1; *электронная почта:janakoo@yandex.ru 2Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Министерства здравоохранения РФ, 117997, Москва, ул. Саморы Машела, 1 3Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ, 125167, Москва, Новый Зыковский пр., 4 4Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, физический факультет,
119991, Москва, Ленинские горы, 1 Поступила в редакцию 22.12.2014 г.
Важнейшие участники системы гемостаза — специализированные клетки тромбоциты — при активации разделяются на две субпопуляции, сильно отличающиеся по своим свойствам. Тромбоциты одной из субпопуляций экспрессируют фосфатидилсерин на внешнем слое мембраны и удерживают на своей поверхности секретированные из альфа-гранул белки. Мы исследовали возможность участия трансглутаминаз в регуляции этого разделения. Использованные нами синтетические пептиды F11KA и T26, которые ингибируют соответственно фактор XIIIa и тканевую трансглутаминазу, дансилкадаверин, а также конкурентные ингибиторы/субстраты серотонин, цистамин и GTP приводили к снижению количества образующихся фосфатидилсерин(ФС)-положительных тромбоцитов. Однако ингибирующее антитело к тканевой трансглутаминазе не влияло на число ФС-положи-тельных тромбоцитов, а эффект пантрансглутаминазного ингибитора T101 был небольшим (20% для активации тромбином с коллаген-подобным пептидом (CRP)) и статистически недостоверным (р = 0.08). Добавление трансглутаминаз приводило к некоторому статистически значимому увеличению численности ФС-положительной субпопуляции (на 27 и 14% для тканевой трансглутамина-зы и фактора XIIIa соответственно) при активации CRP, но не тромбином. С учетом известной неспецифичности большинства использованных ингибиторов и их высоких концентраций, необходимых для достижения эффекта, полученные данные указывают на возможность вклада трансглутаминаз в формирование прокоагулянтных тромбоцитов при некоторых условиях (стимуляция тромбоцитов через коллагеновый рецептор GPVI), но не поддерживают представление об их определяющей и универсальной роли в этом феномене.
Ключевые слова: тромбоциты, субпопуляции тромбоцитов, тканевая трансглутаминаза, фактор Х111а, фосфатидилсерин, проточная цитометрия, агрегометрия.
Б01: 10.7868/80233475515040052
ВВЕДЕНИЕ
Гемостаз — защитная система организма, осуществляющая остановку кровотечения при повреждении стенки сосуда. Важнейшими участниками гемостаза являются тромбоциты. Исследования последних двух десятилетий показали, что тромбоциты при сильной активации разделяются на несколько субпопуляций, драматически различающихся по своим свойствам [1, 2]. Тромбоциты одной из субпопуляций имеют высокий
уровень фосфатидилсерина на своей поверхности и удерживают на ней различные альфа-гранулярные белки, например фибриноген, тромбоспон-дин, фактор Виллебранда. Они могут служить субстратами для клеточных трансглутаминаз [3] — у-глутамилтрансфераз [КФ 2.3.2.13], катализирующих образование е-(у-глутамил)лизиновых сшивок между белками [4].
Тромбоциты содержат два типа трансглутаминаз: тканевую трансглутаминазу [5] и фактор Х111а [6]. Данные о влиянии этих ферментов на количе-
ство образующихся при активации фосфатидилсе-рин(ФС)-положительных тромбоцитов противоречивы. Dale и соавт. [3] показали, что антитела, ингибирующие фактор XIIIa и блокирующие активацию фактора XIII тромбином, приводят к уменьшению образования субпопуляции тромбоцитов, несущей на своей поверхности белки альфа-гранулярного происхождения. Проведенное нами исследование механизма формирования белкового покрытия на этих тромбоцитах подтвердило, что трансглутаминазы действительно могут способствовать созданию такого покрытия, хотя в большинстве случаев используется, по-видимому, иной механизм [7]. Однако в этих работах анализировали преимущественно белковое покрытие, а не экспозицию фосфатидилсерина. Кроме того, ^lkarni и Jackson [8] показали, что фактор XIIIa может регулировать переход тромбоцитов из проадгезивного типа в прокоагулянт-ный (хотя и тут наблюдение шло скорее за морфологическими признаками тромбоцитов). Однако обнаружилось, что у мышей с дефицитом фактора XIIIa и геморрагическими диатезами (включая высокую степень спонтанных кровотечений и внутриутробную гибель плода), сходными с проявлениями недостаточности этого белка у человека, отсутствие фактора XIIIa не влияет на образование ФС-положительных тромбоцитов и на полную экспрессию Р-селектина (белка альфа-гранулярных мембран) [9].
Целью данной работы было изучение роли трансглутаминаз в регулировании формирования ФС-положительной субпопуляции при активации тромбоцитов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В работе были использованы: факторы свертывания IXa, Х, XIIIa и тромбин человека (Haematologic Technologies, США; Roche, Франция); конвульксин (Pentapharm, Швейцария); простагландин E1 (MP Biochemicals, США); флуоресцеинизотиоцианат^^С^конъ-югированный аннексин V (Molecular Probes, США); PPACK (Calbiochem, США); фактор VIII человека ("Гемофил М", Россия); субстрат S2765 (Chromogenix, Италия); ингибитор T101 (ZEDIRA, Германия); IgG1 мыши против транс-глутаминазы II и контрольный IgG1 (Thermo Scientific, США), которые были дополнительно диа-лизованы перед экспериментом для удаления азида натрия; ингибирующие пептиды T26 (HQSYVDPWMLDH) против тканевой трансглу-таминазы человека и F11KA (DQMMLPWPAVAL) против фактора XIIIa человека [10], синтезированные в лаборатории белковой инженерии в Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича. Коллаген-подобный пептид (CRP) любезно предоставлен
проф. Р.В. Фарндейлом (Университет Кембриджа, Великобритания). Остальные реагенты были фирмы Sigma-Aldrich, США.
Выделение тромбоцитов. Все процедуры, связанные с забором крови, проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией в рамках протокола, утвержденного Комитетом по этике ЦТП ФХФ РАН и ГНЦ МЗ РФ. Письменное информированное согласие было получено от всех доноров. Тромбоциты выделяли из крови здоровых доноров, взятой на 3.8% цитратный буфер (111 мМ цитрат натрия, рН 5.5), соотношение кровь : цитрат составляло 9 : 1; также в кровь добавляли простагландин Е1 (1 мкМ) и апиразу (0.1 ед./мл) для предотвращения активации тромбоцитов. Кровь центрифугировали при комнатной температуре при 100 g в течение 8 мин, после чего отбирали слой богатой тромбоцитами плазмы и добавляли 3.8% цит-ратный буфер в соотношении плазма : цитрат 3 : 1. Тромбоциты концентрировали центрифугированием при 400 g в течение 5 мин при комнатной температуре, ресуспендировали в 300 мкл буфера А (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0.4 мМ NaH2PO4, 5 мМ глюкозы, 0.5% бычий сывороточный альбумин, pH 7.4) и очищали от белков плазмы с помощью гель-фильтрации на колонке (диаметр х высота = 1 см х 6 см) с сефа-розой CL-2B, уравновешенной буфером А.
Проточная цитометрия. Тромбоциты в указанной концентрации активировали путем инкубации с агонистами в буфере А с 2.5 мМ CaCl2 в течение 15 мин в присутствии флуоресцентно меченных антител, разводили в 20 или 10 раз буфером А с 2.5 мМ CaCl2 и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, США) или Accuri C6 (Accuri Cytometers, США) соответственно. Полученные данные обрабатывали с помощью программ WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, США) и CFlow (Accuri Cytometers, США). Процедуру компенсации (учет перекрывания спектров флуоресценции) выполняли во всех случаях двух- и трехцветного анализа.
Агрегация. Тромбоциты в концентрации 105/мкл в буфере А с 2.5 мМ CaCl2 преинкубиро-вали в присутствии 200 мкМ дансилкадаверина или растворителя (0.125% диметилсульфоксида) в течение 3 мин при 37°С. Затем к ним добавляли смесь 10 нМ тромбина и 10 нг/мл конвульксина, и агрегацию образцов анализировали в течение 20 мин на агрегометре (Chrono-Log 490, Chrono-log, Hav-ertown, PA, США) при перемешивании со скоростью 800 об/мин при 37°С. По зависимостям све-топропускания от времени оценивали два параметра: степень агрегации (максимальное за время эксперимента приращение светопропускания) и скорость агрегации (максимальный наклон кривой светопропускания приблизительно на 30% длины линейного участка).
Измерение прокоагулянтной активности тромбоцитов. На поверхности тромбоцитов собирали комплекс внутренней теназы. Для этого к активированным тромбоцитам в концентрации 8 х 103/мкл в буфере А с 2.5 мМ CaCl2 добавляли 27.5 нМ фактора УШа (фактор VIII предварительно активировали в течение 1 мин тромбином, который затем ингибировали 2 мкМ PPACK), 10 нМ фактора IXa и 400 нМ фактора X. Активация фактора X собранным комплексом происходила в течение 4 мин при 37°С. Затем в смесь добавляли 100 мМ EDTA, чтобы остановить активацию фактора X, и 0.4 мМ хромогенного субстрата S2765 на фактор Xa. Начальную скорость гидролиза субстрата оценивали по изменению оптической плотности раствора на длине волны 405 нм при 37°C в течение 30 мин с помощью планшетного спектрофотометра Ther-momax (Molecular Devices, США).
В качестве активатора тромбоцитов использовали 100 нг/мл конвульксина с добавлением 500 нМ тканевой трансглутаминазы либо сразу, либо через 9 мин после начала активации (полное время активации 15 мин). В качестве контроля использовали образцы с тромбоцитами, которые не активировались или стимулировались 100 нг/мл конвульксина без тканевой трансглутаминазы.
Статистический анализ производили в программе OriginPro 7.5 (Microcal Software, США) с использованием парного критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Роль трансглутаминаз в регулировании количества ФС-положительных тромбоцитов мы изучали с использованием максимальн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.