МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 449-454
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.243.4.577.124.5
РОЛЬ ТРЕГАЛОЗЫ И ГЛИКОГЕНА В ПОДДЕРЖАНИИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ СТАРЕЮЩИХ КЛЕТОК БАССИАЯОМУСЕБ СЕЯЕУШАЕ
© 2004 г. В. А. Самохвалов*1, Г. В. Мельников*, В. В. Игнатов**
*Саратовский государственный университет **Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов
Поступила в редакцию 26.05.03 г.
Целью данной работы являлось исследование роли трегалозы и гликогена (запасных углеводов) в поддержании жизнеспособности стареющих клеток БассМтошусеъ сетеу181ав. Старение культуры в течение первой недели не приводило к снижению жизнеспособности клеток. В это время в клетках происходило усиленное накопления запасных углеводов, а также увеличение активности гексоки-назы и фофсфофруктокиназы. Дальнейшее старение приводило к резкому снижению жизнеспособности клеток стареющей культуры и, параллельно с этим, к падению содержания в них как гликогена, так и трегалозы. Активность гликолитических ферментов также снижалась в процессе старения культуры сетеу(81ае. Возможные причины снижения способности стареющих клеток сетеу(81ае аккумулировать гликоген и трегалозу дискутируются в работе.
Ключевые слова: старение, гликоген, трегалоза, гликолитические ферменты, 8ассМтошусе5 сетеу1з1ае.
Исследования Saccharomyces cerevisiae показали, что метаболический контроль и его дисфункции являются важным механизмом, ответственным за контроль старения в клетках дрожжей [1]. Важным достижением последних лет является выявление группы генов, регулирующих старение клеток [1] и ответственных за их адаптацию к условиям стационарной фазы [2]. Поскольку эти гены также участвуют в регуляции различных метаболических реакциях, это дает основание считать, что старение клеток S. cerevisiae, является сложным, комплексным процессом, во многом сходным с таковым у клеток млекопитающих [3].
В настоящее время различают два основных механизма старения дрожжевых клеток - репли-кативное и хронологическое. Репликативное старение представляет собой способность материнской клетки к репродукции почек и измеряется непосредственно количеством образованных почек. Аналогом его является пролиферативная жизнь клеток млекопитающих. Второй тип старения - хронологический отражает постмитотичес-кое существование культуры. Аналогом хронологического старения дрожжевой клетки является жизнь митотически неактивных фибробластов в многоклеточном организме. Именно исследование механизмов хронологического старения позволяет наиболее адекватно выявлять изменения сопряженные со старением, поскольку в этом случае отсутствует разбавление популяции вновь
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: samokhvalov@mail.ru).
отпочковавшимися клетками, что может служить причиной нежелательных артефактов.
Хорошо известно, что метаболизм гликогена и трегалозы у сетеу181ае тесно связан со многими клеточными функциями [4]. Интересными являются данные об участии этих резервных углеводов в регуляции клеточного цикла [5]. Было показана тесная функциональная взаимосвязь метаболизма гликогена и трегалозы с клеточным ростом [6]. Поскольку старение клеток дрожжей, является, как уже говорилось выше сложным комплексным процессом, вовлекающим множество метаболических путей, представляет интерес исследовать динамику содержания гликогена и трегалозы в условиях хронологического старения клеток сетеу181ае.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штамм дрожжей "Бас-chaтomyces ceтevisiae У-1173", любезно предоставленный проф. В.М. Вагабовым (ИБФМ РАН, Пущино). Культивирование осуществляли в колбах объемом 700 мл, содержащих 200 мл синтетической среды Ридер, на качалке (200 об/мин), при 28°С. Рост дрожжей оценивали спектрофотомет-рически на Сф-46 при 540 нм, с пересчетом на вес сухой биомассы по калибровочному графику. Для моделирования старения клеток мы использовали систему пролонгированной стационарной фазы, где направленно избегалось голодание клеток
Жизнеспособность, % 100г
80604020_I_I_I_I_I
0 1 2 3 4 5
Время старения культуры, нед.
Рис. 1. Изменение жизнеспособности клеток в стареющей культуре S. cerevisiae. За 100% принято число КОЕ в начале эктерилинита (время "0").
по компонентам среды выращивания. Необходимым предварительным этапом было выяснение критической плотности популяции, при которой клетки не почкуются при наличии всех компонентов питательной среды. Для нашего штамма такая плотность соответствовала 22 ед. опт. пл. При такой плотности популяции клетки переходят в постмитотическое состояние, обусловленное эффектом "crowd-sensing". Исходя из полученных результатов, клетки из поздней экспоненциальной фазы концентрировали до определенной критической плотности популяции в среде выращивания. Полученную суспензию клеток инкубировали в течении 12 ч и отбирали первую пробу. Этот момент принимали условно за старт эксперимента, т.е. за время "0". В дальнейшем, клеткам дважды в неделю позволяли осесть на дно колбы при 5°C, при этом старую среду заменяли на эквивалентный объем свежей. Мы не наблюдали дополнительного роста клеток после этой процедуры. Отбор проб производили один раз в неделю, для этого клетки собирали центрифугированием при 3000 g, и дважды отмывали холодной бидистиллированной водой. О жизнеспособности дрожжей судили по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высесе клеточных суспензий на сусло-агар, принимая за 100% число КОЕ в начале эксперимента (время "0"). Гликоген и трегало-зу определяли по методу [7], выживаемость методом [8]. Гексокиназу (2.7.1.1), фосфофруктокина-зу (2.7.1.11), определяли, как описано в работе [9]. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли спектрофотометрически, по накоплению в клетках продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты) [10]. Количество карбонильных групп определяли нижеследующим образом: клетки,
трижды отмытые в холодном 50 мМ калий-фосфатным буфере (рН 7.4), были ресуспендированы в нем же до конечной концентрации 20 мг/мл абсолютно сухой биомассы. Суспензию делили на две равные части по 0.5 мл, после чего добавляли в каждую по 0.5 мл 10% ТХУ. После центрифугирования при 10000 g в течение 15 мин супернатан-ты были отброшены. К осадкам были добавлены по 1 мл либо 2 М HCl (контрольная проба), либо 0.2% раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М HCl (опытная проба) соответственно. После этого контрольная и опытная проба были проинкубированы в течении 1 ч при 37°C. После инкубации в каждую пробу было добавлено по 600 мг гу-анидингидрохлорида. После центрифугирования в течении 15 мин при 10000 g, экстинкция проб была замерена на спектрофотометре СФ-46 при 540 нм. Для вычисления количества карбонильных групп использовали коэффициент молярной экстинкции гидразона 21.0 ммоль-1 см-1.
Оптическую плотность культуры измеряли на спектрофотометре СФ-46 при 600 нм, с дальнейшем пересчетом на сухую биомассу по калибровочному графику. Белок определяли по методу Лоури. В работе использовали реактивы фирмы "Sigma".
Все описанные эксперименты были проведены в 3 повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для правильной постановки экспериментов было необходимо выяснить, каким образом регулярная замена среды культивирования на свежую может воздействовать на метаболизм запасных углеводов в клетках дрожжей. В ходе проверочных экспериментов, мы выяснили, что, хотя замена среды и приводит к некоторым кратковременным колебаниям содержания запасных углеводов в клетках, но, тем не менее, не оказывает существенного влияния на динамику их изменений в процессе старения культуры. Тоже самое, можно сказать, об активности гликолитических ферментов. Замена среды не приводила также к появлению почкующихся клеток. В наших условиях это легко можно объяснить тем, что клетки достигали критической плотности популяции (эффект "crowd-sensing"), что является фактором, сдерживающим почкование. Этот аспект является весьма важным, поскольку он обеспечивает, истинное, постмитотическое хронологическое старение клеток. Другим важным фактом является то, что использованная нами экспериментальная модель позволяет пренебречь эффектом воздействия истощения среды и накопления в ней токсических продуктов метаболизма на процесс хронологическое старения клеток S. cerevisiae.
ОПбоо
Время старения, нед.
Рис. 2. Изменение оптической плотности стареющей культуры 5. cerevisiae.
Содержание гликогена и трегалозы в клетках, мг/г сухой биомассы
Время старения культуры, нед.
Рис. 3. Динамика содержания гликогена (1) и трегалозы (2) в стареющих клетках 5. cerevisiae.
Как показано на рис. 1, до второй недели эксперимента динамика снижения числа жизнеспособных клеток стареющей культуры была медленной.
С третьей недели старения происходило резкое снижение их численности, достигающее 44%, в дальнейшем этот процесс шел гораздо более медленными темпами. К концу эксперимента количество жизнеспособных клеток упало до 36% по сравнению с исходным уровнем. Подобная же закономерность была обнаружена нами при измерении динамики оптической плотности культуры (рис. 2). На протяжении всего периода старения культуры выявлялось увеличение размеров клеток. При этом вплоть до конца эксперимента мы не наблюдали почкующихся клеток (данные не представлены).
Мы обнаружили интересную закономерность. Старение культуры в течение первой недели приводило к увеличению содержания как гликогена, так и трегалозы в клетках, с выходом на плато в течение второй недели старения культуры. Однако, начиная с третий недели старения, содержание запасных углеводов в клетках стареющей культуры резко падало, и после 4-й недели старения гликоген и трегалоза не обнаруживались вплоть до конца эксперимента (рис. 3). Интересным является тот факт, что несмотря на отсут-
ствие в клетках после третьей недели старения как гликогена, так и трегалозы, жизнеспособность дрожжей сохранялась на уровне 36% от исходного уровня.
Известно, что метаболизм запасных углеводов в дрожжевой клетке тесно связан с гликолитиче-ским потоком [11]. В связи с этим, интересно проследить изменения в активности основных фермент
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.