БИОХИМИЯ, 2012, том 77, вып. 2, с. 223 - 230
УДК 577.152.311
РОЛЬ ЦЕРАМИДОВ В НАРУШЕНИИ ФОСФОЛИПАЗА Д-ЗАВИСИМОГО СИГНАЛИНГА ИНСУЛИНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ СТАРЫХ КРЫС
© 2012 г. Н.А. Бабенко*, В.С. Харченко
Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, Отдел физиологии онтогенеза НИИ биологии, 61077Харьков, пл. Свободы, 4, Украина; электронная почта: babenko@univer.kharkov.ua
Поступила в редакцию 20.06.11 После доработки 29.09.11
Церамид является новым классом молекул биоэффекторов, которые участвуют в регуляции различных сигнальных путей. Установлена важная роль церамида в регуляции активности фосфолипазы Д и развитии резистентности клеток к действию инсулина. В настоящей работе изучены возрастные особенности регуляции инсулином активности фосфолипазы Д и обмена глюкозы в интактных клетках и условиях моделирования с помощью экзогенного церамида и пальмитиновой кислоты состояния их резистентности к действию гормона. Установлено, что содержание церамидов и свободных жирных кислот увеличивается с возрастом, а также при инкубации клеток печени молодых крыс в присутствии предшественника синтеза церамида — пальмитиновой кислоты. В данных условиях происходит резкое снижение способности инсулина активировать фосфолипазу Д, поглощение глюкозы клетками и синтез гликогена. При инкубации клеток молодых животных в присутствии экзогенного С2-церамида происходит увеличение содержания эндогенных церамидов, но не свободных жирных кислот и нейтральных липидов. Этот процесс сопровождается подавлением стимулированного инсулином образования фосфатидилэтанола (продукта реакции трансфос-фатидилирования этанола фосфолипазой Д), поглощения глюкозы и синтеза гликогена. Инкубирование резистентных к действию инсулина клеток печени молодых крыс, а также гепатоцитов старых крыс, в присутствии мириоцина (ингибитора синтеза церамида de novo) сопровождалось снижением содержания цера-мида в клетках и увеличением чувствительности клеток к действию гормона. Полученные данные свидетельствуют о важной роли церамида в нарушении передачи сигнала инсулина путем ингибирования фосфо-липаза Д-зависимого звена в клетках печени старых животных.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: церамид, мириоцин, фосфолипаза Д, гепатоциты, инсулинорезистентность, старение.
Церамид является важным регулятором роста и апоптоза клеток и образуется в результате гидролиза сфингомиелина различными сфинго-миелиназами или путем синтеза de novo. С возрастом в печени крыс происходит усиление обмена сфинголипидов [1, 2]. Повышение активности сфингомиелиназ и накопление церамида при старении происходит в фибробластах [3], печени и гиппокампе крыс [4, 5]. Церамид регулирует биохимические и генетические процессы, которые происходят при старении [6]. Высокое содержание церамида в клетках приводит к подавлению сигнальных путей, ответственных за передачу гормональных сигналов, в том числе
Принятые сокращения: ФЛД — фосфолипаза Д; ФХ — фосфатидилхолин; ФК — фосфатидная кислота; ФЭТ — фосфатидилэтанол; ПКС — протеинкиназа С; СЖК — свободные жирные кислоты; 16 : 0 — пальмитиновая кислота; ГЛЮТ — транспортер глюкозы; ФИЗК — фосфатидилино-зитол-3-киназы; ДАГ — диацилглицерол.
* Адресат для корреспонденции.
и инсулина, что может со временем вызывать инсулинорезистентность [7]. В печени и мышцах инсулинорезистентных крыс уровень церамида значительно выше, чем у нормальных животных [8].
Известно, что одной из мишеней для действия инсулина является фосфолипаза Д (ФЛД). Индуцированная инсулином активация фосфатидилхолин-специфической (ФХ-специ-фической) ФЛД в плазматической мембране наблюдается в адипоцитах крыс, ВС3Н-1 мио-цитах и гепатоцитах крыс [9]. В клетках НЕК 293 и гепатоцитах крыс инсулин стимулирует протеинкиназа С (ПКС)- и ФЛСу-зависимую активность ФЛД [10, 11]. В адипоцитах крыс инсу-лин-индуцированная активация фосфатидил-инозитол-3-киназы приводит к продукции поли-фосфоинозитидов в плазматической мембране с последующей транслокацией ЯИо, активацией ФЛД [12] и усилением транспорта глюкозы. В настоящее время показано, что инсулин активирует ФЛД в тех типах клеток, где происходит
транслокация транспортера глюкозы ГЛЮТ-4 [13]. ФЛД, наряду с атипичными формами ПКС 4 и X и протеинкиназой В, участвует в регуляции ключевого этапа транспорта глюкозы, а именно транслокации транспортеров глюкозы из эн-доплазматического ретикулума в плазматическую мембрану [13]. Существуют данные о том, что молекулярные механизмы управления транслокацией ГЛЮТ-2 и ГЛЮТ-4 идентичны, поскольку сигнальный путь ФИ3К/ФЛД/ПКС участвует в регуляции трафика этих транспортеров [14, 15].
В стареющих фибробластах обнаружены дефекты функционирования сигнального пути, опосредованного ФЛД/ДАГ/ПКС, что, как предполагают, связано с накоплением церамида [16]. Согласно Сингх и соавт. [17], церамид ин-гибирует ФЛД, конкурируя с фосфоинозитидом Р1ё1ш(4,5)Р2 за каталитическое ядро фермента. В то же время показано, что церамид частично блокирует транслокацию активаторов ФЛД белка АКР и ПКС и таким образом снижает активность ФДД [18]. Кроме того, нарушение структуры липидных рафтов церамидами коррелирует с ингибированием ФЛД [19].
В настоящее время остается нерешенным вопрос о том, каковы механизмы развития ин-сулинорезистентности печени в старости и каким образом в этот процесс вовлечены ФДД и церамиды. Задачей данной работы является изучение возрастных особенностей ФЛД-зависи-мого звена передачи сигнала инсулина в клетках печени, выяснение роли церамида в нарушении этого процесса и возможности коррекции состояния резистентности к действию гормона в старых клетках с помощью модулирования обмена сфинголипидов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводили на трех- и 24-месячных крысах-самцах линии Вистар. Перед вскрытием брюшной полости животных наркотизировали диэтиловым эфиром. Гепатоциты выделяли по методу Петренко и соавт. [20]. На-тивность клеток оценивали с помощью трипа-нового синего. Выживаемость клеток составила 90—96%. Свежевыделенные гепатоциты ресус-пендировали в среде Игла (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Россия), содержавшей 10%-ную эмбриональную сыворотку (ООО «БиолоТ», Россия), 20 мМ Иере8, пенициллин (61 мг/л), стрептомицин (100 мг/л), ~4 • 107 клеток/мл и инкубировали 3 ч при 37° в присутствии 5 мкг (на 1 мл среды) С2-церамидаф-эритро-^-ацетилсфингозин) («АтегеИат», Анг-
лия), или пальмитиновой кислоты (16 : 0) (0,75 мМ) («Sigma», США), или контрольной смеси (доде-кан : этанол, 49 : 1, в эквивалентном объеме). Перед внесением в среду 16 : 0 была комплекси-рована с БСА («Sigma») как описано ранее [21]. Для ингибирования синтеза церамида de novo в среду инкубации гепатоцитов трехмесячных крыс за 30 мин до внесения 16 : 0 или С2-цера-мида добавляли 5 мкМ мириоцина («Sigma»). Общее время инкубации с ингибитором составило 3 ч. Гепатоциты 24-месячных крыс в присутствии мириоцина также инкубировали 3 ч при 37°. После инкубации гепатоциты отмывали буфером Кребса—Хенселейта с 0,1%-ным БСА и разводили перед началом эксперимента в том же буфере. Концентрация гепатоцитов составляла ~2 • 107 клеток/мл. Далее определяли индуцированные инсулином («Индар», Украина) поглощение [3Н]^-глюкозы (0,5 мкКи/мл) клетками и включение [и14С]^-глюкозы (0,1 мкКи/мл) в гликоген по методу [22]. Радиоактивность меченых [3Н]^-глюкозы и [14С]гликогена определяли с помощью счетчика радиоактивности БЕТА.
Для определения активности ФЛД использовали метод, основанный на образовании фос-фадилэтанола (ФЭТ), фосфолипида, который образуется исключительно ФЛД через трансфосфа-тидилирование в присутствии этанола [23—26]. ФЭТ, в отличие от ФК, метаболизируется очень медленно и ввиду этого является индикатором активации ФЛД в стимулированных клетках. Для определения активности ФЛД суспензию гепа-тоцитов инкубировали в присутствии [14С]паль-митиновой кислоты (16 : 0) (0,25 мкКи/мл) («Amersham») в течение 90 мин, затем клетки отмывали буфером Кребс—Хенселейт с 0,1%-ным БСА и разводили в том же буфере до концентрации 2 • 107 клеток/мл. Перед внесением гормона в среду инкубации клетки прединкубировали 10 мин с 300 мМ этанолом, затем в среду вносили инсулин (10 нМ) или 0,9%-ный NaCl (в качестве контроля к инсулину) и через 5 или 30 мин останавливали реакцию. Экстракцию липидов проводили согласно метода [27]. Разделение отдельных липидов проводили с помощью ТСХ на пластинках Sorbfil («Сорбполимер», Россия) в системах растворителей — СН3СООСИ2СИ3 : изооктан : СН3СООН : Н2О (130 : 20 : 30 : 100, по объему) — для ФЭТ; гексан : диэтиловый эфир : : ледяная СН3СООН (73 : 25 : 2, по объему) — для свободных жирных кислот (СЖК). Для разделения фосфо- и сфинголипидов использовали системы: CH3CH2OCH2CH3 (система 1) и CHCl3 : : CH3OH : Н2О (40 : 10 : 1, по объему) (система 2). Пятна липидов проявляли в парах йода и идентифицировали, сравнивая со стандартами. Содержание нейтральных липидов в пробах опре-
деляли по методу Марча и Вейнстейна [28], фос-фолипидов — по методу Бартлета [29]. Для количественного определения содержания церами-дов в клетках пятна липидов переносили в пробирки и элюировали смесью хлороформа с метанолом (1 : 1, по объему) с последующим элю-ированием метанолом. Объединенные элюаты выпаривали в вакууме и подвергали гидролизу в 0,5 М НС1 в метаноле при 65° в течение 15 ч. Массу церамидов определяли по высвобождению длинноцепочечных оснований в ходе гидролиза липидов [30]. Данные представлены в виде — среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения двух групп использовали 11-критерий Стьюдента, для сравнения данных, полученных в результате множественного воздействия, использовали многофакторный дисперсионный анализ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Установлено, что при кратковременной стимуляции гепатоцитов молодых крыс инсулином происходит активация ФЛД. Прямым доказательством этого является индукция гормоном образования [14С]ФЭТ — продукта специфической для ФЛД реакции трансфосфатидилирова-ния этанола (рис. 1, а). Инсулин приводит также к снижению в клетках уровня субстрата ФЛД — ФХ (рис. 1, а) и усилению поглощения гепато-цитами трехм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.