МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 2, с. 131-138
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.8.043
РОЛЬ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПОЛИМЕРНОГО МАТРИКСА В УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ © 2013 г. Е. А. Стрелкова, Н. В. Позднякова, М. В. Журина, В. К. Плакунов1, С. С. Беляев
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 14.07.2012 г.
Установлено, что биопленки ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий (как изолированных из пластовых вод нефтяного месторождения, так и коллекционных штаммов) обладают повышенной по сравнению с планктонными культурами устойчивостью к экстремальным физико-химическим условиям среды (неблагоприятной температуре, рН и концентрации соли). Показано, что существенную роль в этой устойчивости играют внеклеточные полимерные вещества, составляющие структуру матрикса биопленки, поскольку при подавлении образования матрикса под воздействием суббактериостатических концентраций антибиотика азитромицина (в случае Pseudomonas acephalitica), а также в результате мутации гена cvil, кодирующего синтетазу N-гексаноилгомо-серинлактона (в случае Chromobacterium violaceum CV026), чувствительность биопленок к экстремальным факторам среды снижается практически до уровня планктонных культур. Обсуждается значение матрикса биопленки для выживания бактерий в экстремальных условиях.
Ключевые слова: биопленки, матрикс, внеклеточные полимерные вещества, антибиотик азитроми-цин, система quorum-sensing, экстремальные факторы среды.
DOI: 10.7868/S0026365613020158
Закономерности формирования структурированных микробных сообществ (биопленок) подробно рассмотрены в недавно опубликованных обзорах и монографиях [1—4]. Поэтому мы остановимся лишь на одной проблеме, имеющей непосредственное отношение к теме данного исследования и недостаточно освещенной в научной литературе: составе и роли внеклеточных полимерных веществ (ВПВ, или "extracellular polymeric substances", EPS), входящих в матрикс биопленки.
Матрикс определяет формирование трехмерной структуры биопленки, удерживает микробные клетки, обеспечивая их контакт и предохраняя от сил гидродинамического сдвига на поверхности раздела жидкость-твердое тело. Полагают, что матрикс играет защитную роль, повышая устойчивость микробных клеток к воздействию биоцидов и агентов иммунной системы макроорганизма. К сожалению, в научной литературе до сих пор недостаточно сведений о механизмах формирования и функционирования матрикса. Лучше всего исследован его состав у биопленок, образуемых представителями грамотрицательных бактерий (главным образом, рода Pseudomonas), а
1 Автор для корреспонденции (e-mail: plakunov@inmi.host.ru).
также некоторыми грамположительными бактериями [5, 6].
Наиболее изученным объектом является Pseudomonas aeruginosa, вызывающий хронические легочные инфекции (муковисцидоз) у лиц с нарушениями иммунной системы, а также формирующий биопленки — обрастания на контактных линзах и внедряемых в макроорганизм катетерах [7].
Матрикс биопленки P. aeruginosa представляет собой сложную смесь экзополисахаридов, белков и нуклеиновых кислот (в основном ДНК) [8]. Главными структурными компонентами являются полисахариды. У P. aeruginosa в матриксе биопленки присутствуют по крайней мере три эк-зополисахарида: Psl (содержащий в качестве основного компонента маннозу), Pel (содержащий в качестве основного компонента глюкозу), а также альгинат (кислый полисахарид, содержащий уроновые кислоты). Достаточно хорошо изучена роль экзополисахарида Psl, который обеспечивает взаимодействие клеток, образующих биопленку, располагаясь на их поверхности в виде спиральных структур. При созревании биопленки Psl участвует в формировании полостей в трехмерных микроколониях бактерий, в которых появляются подвижные клетки, обеспечивающие рассе-
ление микроорганизма в процессе диссоциации биопленки. Химическое удаление Psl с поверхности бактериальных клеток приводит к разрушению матрикса [5].
Кроме экзополисахаридов матрикс содержит переменное количество белков (среди которых возможно присутствие веществ, способствующих адгезии клеток на поверхности раздела), а также внеклеточную ДНК (eDNA), функции которой не вполне понятны, хотя постулируется ее участие в адгезии клеток, межклеточных взаимодействиях, создании градиента катионов и, наконец, в проявлении индуцибельной устойчивости к антибиотикам [5].
В случае грамположительных бактерий наиболее изученными в отношении образования биопленок являются представители родов Bacillus (модельный микроорганизм B. subtilis), Staphylococcus и Streptococcus — последние, главным образом, благодаря их участию в формировании поливидовых биопленок (зубных бляшек), а также их роли в возникновении внутрибольничных инфекций и в обрастании внедряемого в макроорганизм медицинского инструментария [6].
Изученные штаммы B. subtilis образуют два типа ВПВ: экзополисахарид и поли-^-глутамат в разных соотношениях. Оба ВПВ необходимы для образования полноценных биопленок. Большинство штаммов S. aureus образуют полимер ^-аце-тилглюкозамина, участвующий в формировании биопленок и выполняющий, в частности, роль адгезина. Однако дефект оперона ica, ответственного за синтез данного полисахарида, компенсируется образованием ряда альтернативных белковых адгезинов (Bap-белков). В отличие от S. aureus, у B. subtilis в состав матрикса биопленки входит только один белок (TasA), выполняющий роль ад-гезина. Мутант с нарушенным синтезом этого белка неспособен формировать биопленку, несмотря на сохранение способности к образованию эк-зополисахарида. Недавно было показано, что TasA может существовать в виде внеклеточных филамент со свойствами белка-амилоида, играющего важную структурную роль в матриксе биопленки [6].
Поскольку в научной литературе практически отсутствуют сведения о механизмах участия мат-рикса биопленок в защите входящих в них микроорганизмов от экстремальных условий среды, в задачу данной работы входило изучение устойчивости биопленок грамположительных и грамот-рицательных бактерий к тепловому воздействию, гиперосмотическому и кислотному шоку и влияния на эту устойчивость целостности биопленочного матрикса.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изоляты галотолерантов-нефтеокислителей Di-etzia sp., Kocuria sp. и галофила Chromohalobacter sp., а также нефтеокислителя Pseudomonas acephalitica выделены из пластовых вод Ромашкинского нефтяного месторождения (республика Татарстан) [9]. Коллекционные штаммы P. chlororaphis 66, Chromo-bacterium violaceum WT и мутанта C. violaceum CV026 получены от проф. И.А. Хмель (из коллекции Института молекулярной генетики РАН).
Микроорганизмы сохраняли на среде LB в столбиках под вазелиновым маслом (для галофила Chromohalobacter sp. добавляли 10% NaCl) при 4—6°С кроме культур Chromobacterium, которые хранили при комнатной температуре (мутант CV026 в присутствии 100 мкг/мл канамицина). Для приготовления инокулята бактерии выращивали на среде LB при 29°С на качалке (150 об/мин) в течение 20—24 ч; в среду для мутанта C. violaceum CV026 вносили 100 мкг/мл канамицина. Эти культуры использовали в опытах с биопленками.
Для сравнения планктонных культур и биопленок использовали предложенный нами метод с использованием тефлоновых блочков [10]. В этом случае для формирования биопленок в пробирку с 4 мл среды LB вносили 50 мкл инокулята, 2 г тефлоновых блочков (размер 2 х 2 х 2 мм), на которых формировались биопленки. После завершения инкубации (24 ч) планктонную культуру отделяли, и рост измеряли по величине условной оптической плотности (светопоглощение + светорассеяние) при 540 нм. Блочки отмывали от планктонных клеток 1% раствором NaCl и биопленки фиксировали 96% этанолом. После удаления спирта окрашивание биопленок производили 0.1% раствором красителя кристаллического фиолетового (КФ). В параллельных опытах для окрашивания матрикса биопленок использовали краситель 1,9-диметилметиленовый синий (1,9-dimethylm-ethylene blue, DMMB) по стандартной методике [11]. После экстракции красителей 96% этанолом оптическую плотность растворов измеряли при 590 нм (в случае кристаллического фиолетового) или при 540 нм (в случае DMMB).
В экспериментах по измерению зависимости роста от температуры культивирования использовали биопленки, предформированные при оптимальной температуре в течение 6 ч, когда заканчивается период реализации "биопленочного фенотипа" [10]. После завершения этого процесса культуры переносили в термостаты с исследуемыми температурами.
В опытах с азитромицином предформирование биопленок осуществляли в присутствии 0.5 мкг/мл этого антибиотика. В случае измерения зависимости роста от концентрации соли и рН использовали биопленки в стадии формирования без предин-кубации. Состав и количество осмопротекторов в
% от оптимальной
24 29 34 37 43
Температура, °С
Рис. 1. Зависимость роста планктонных культур и биопленок изучаемых бактерий от температуры: 1, 3, 5 — планктонные; 2, 4, 6 — предформированные биопленки (по окрашиванию КФ); 1, 2 — Б1е1?,1а 8р.; 3, 4 — Коеыпа 8р.; 5, 6 — Р. еМв-roraphis. На оси ординат — результаты в % от данных при оптимальной температуре (29°С) для каждой культуры.
бинарных биопленках (из культур галотолеранта Dietzia Бр. и галофила Chromohalobaеter Бр.) определяли по ранее описанной методике [9] после выращивания биопленок на целлофановых фильтрах в чашках Петри на среде LB в присутствии 10% №С1. Сравнение проводили с монокультурами галофилов, выращенных в тех же условиях. Количество экстракта, наносимого на хромато-грамму, нормировали путем пересчета на единицу биомассы галофила. Для этого культуры с фильтров смывали 96% этанолом и после экстракции эктоина определяли общую сухую биомассу. В случае бинарных биопленок осадок после экстракции эктоина обрабатывали 10 мл дистиллированной воды при рН 8.5 с добавлением 1—2 мг ДНКазы и 5 мг М§804 • 7Н20. При этом наступал полный лизис клеток галофила. Остаток после центрифугирования и повторного промывания высушивали для определения сухой биомассы га-лотолеранта-нефтеокислителя. Биомассу г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.