ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 1, с. 40-44
УДК 579.6
РОСТ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ АФЛАТОКСИНА В1 ДО И ПОСЛЕ ЕГО ОБРАБОТКИ НАНОАЛМАЗАМИ
© 2010 г. О. А. Могильная, А. П. Пузырь, В. С. Бондарь
Институт биофизики СО РАН, Красноярск, 660036 Россия e-mail: ol_mog@mail.ru Поступила в редакцию 12.12.2008 г.
Исследовано влияние афлатоксина В1 (АфВ1) на рост и люминесценцию морских светящихся бактерий P. phosphoreum и светоизлучающих клеток E. coli рекомбинантного штамма Z905. Обнаружен разнонаправленный эффект действия АфВ1 на изучаемые виды бактерий — ингибирование люминесценции P. phosphoreum и активация излучения света E. coli. Показано, что АфВ1 оказывает действие на люминесценцию клеток свежевыращенных культур и бактерий, восстановленных после лиофилизации. Установлено, что после взаимодействия с модифицированными наноалмазами (МНА) детонационного синтеза эффект действия АфВ1 нивелируется. После обработки МНА ми-котоксин в концентрациях, превышающих EC20, не вызывает достоверного изменения люминесценции исследуемых видов бактерий по сравнению с контролем. Обсуждаются возможности применения бактерий P. phosphoreum и E.coli в биолюминесцентном мониторинге АфВ1 и использования МНА для дезактивации микотоксинов.
Загрязнение кормов и продуктов питания токсинами микроскопических грибов является одной из актуальных современных проблем. В частности, опасность представляют афлатоксины - вторичные метаболиты плесневых грибов Aspergillus fla-vus, A. parasiticus и A. nomius [1, 2]. Их содержание в продовольственном сырье, пораженном указанными видами грибов, может достигать достаточно высокого уровня, что, в связи c цитотоксическими и канцерогенными свойствами микотоксинов, представляет серьезную угрозу здоровью человека и животных. Известно, что в ряду афлатоксинов наиболее выраженным мутагенным действием и канцерогенными свойствами обладает афлаток-син B1 (АфB1) [1—3]. Надо заметить, что пороговых концентраций, при которых афлатоксины не оказывали бы своего токсического действия, не существует.
Из изложенных выше фактов очевидна актуальность совершенствования известных и разработка новых (простых, доступных и высокочувствительных) методов тестирования микотоксинов (в частности, афлатоксины), различных способов их нейтрализации и выведения из организма, что будет иметь большое значение не только для быстрого их обнаружения, но и своевременной профилактики, диагностики и лечения микотоксикозов.
Многочисленные исследования посвящены созданию методов выявления афлатоксинов в продовольственном сырье и продуктах питания, разработке способов их детоксикации с помощью сорбентов [4—7], изучению возможности удаления
микотоксинов из среды посредством связывания с клетками живых бактериальных культур [8, 9].
В связи с этим весьма перспективными для тестирования микотоксинов являются биолюминесцентные методы, основанные на применении светящихся бактерий [10—14]. Эти методы обеспечивают экспрессность, простоту измерения и высокую чувствительность обнаружения в отличие от более затратных химических методов анализа. Несомненный интерес для связывания и (или) нейтрализации микотоксинов могут представлять наноалмазы, получаемые методом взрывного синтеза. Физико-химические свойства детонационных наноалмазов (прежде всего, высокоразвитая полиморфная химически активная поверхность наночастиц [15]) определяют их высокие сорбци-онные свойства к биомолекулам и каталитическую активность в органических реакциях [16, 17].
Цель работы — изучение роста и биолюминесценции морских бактерий Photobacterium phospho-reum и рекомбинантных светящихся бактерий Escherichia coli под воздействием АфВ1 до и после его обработки наноалмазами.
МЕТОДИКА
Штаммы и реагенты. Объектами исследования являлись бактерии E. coli, штамм Z905, содержащие рекомбинантную плазмиду pPHL7 с генами бактериальной люминесцентной системы P. leiog-nathi (luxCDABE, ampR) [18], и бактерии P. phosphoreum, штамм 1883, из коллекции ИБСО РАН
(http://www.ibp.ru/collection/). В экспериментах применяли также препараты Микробиосенсор В17-677F и Микробиосенсор ЕСК [13], созданные на основе лиофилизированных бактерий P. phosphoreum, штамм 1883, и E. coli, штамм Z905/pPHL7 соответственно.
В работе использовали препарат АфВ1 (ампулы, содержащие 10 мкг микотоксина в 1 мл ацето-нитрила), производимый Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ, Москва) в качестве эталона для ВЭЖХ. Для экспериментов исходный раствор АфВ1 (концентрация 10 мкг/мл) готовили замещением ацетонитрила деионизованной водой. Рабочие растворы мико-токсина получали разведением исходного раствора деионизованной водой.
Методы. Для культивирования бактерий P. phosphoreum использовали полусинтетическую среду следующего состава (г/л): КН2РО4 • 12Н2О — 1, №2НРО4 • 12Н2О - 6, (NH4)2HP04 - 0.5, MgS04 • • 7Н2О — 0.2, NaCl — 30, пептон — 5; глицерин — 3 мл. Выращивание клеток E. coli проводили в жидкой среде LB (Luria—Bertani) с добавлением ампициллина (0.05 г/л).
Бактерии инокулировали в 20 мл свежей питательной среды, помещенной в колбы объемом 50 мл. Перед началом культивирования в среды опытных образцов добавляли АфВ1 до концентрации 0.005—0.15 мкг/мл. Клетки культивировали на качалке 0S-10 ("BIOSAN", Латвия) в течение 10 ч при 20°С и скорости перемешивания 200 об/мин. Динамику роста клеток контролировали по приросту величины оптической плотности культуры, регистрируемой с помощью спектрофотометра UVIKON 943 ("Kontron Instruments", Италия) при 670 нм.
Интенсивность биолюминесценции бактерий измеряли при 20—22°С с помощью люминометра БЛМ 8801 (СКТБ "Наука", Красноярск, Россия). Величину люминесцентных сигналов регистрировали с помощью самописца 2210 ("LKB", Швеция).
Перед началом работы с препаратами Микро-биосенсор В17-677F и Микробиосенсор ЕСК во флаконы, содержащие лиофилизированные бактерии, добавляли по 1 мл дистиллированной воды и после перемешивания выдерживали суспензии в течение 1 ч при 4°С для восстановления бактериальными клетками светоизлучающей функции. В кювету люминометра вносили 1 мл 3%-ного раствора NaCl (для клеток препарата B17-677F) или 1 мл дистиллированной воды (для клеток препарата ECK), 50 мкл препарата бактерий, добавляли 20— 25 мкл водного раствора АфВ1 определенной концентрации. Измерения биолюминесценции проводили через 15 мин инкубации клеток с токсином. В контроль вместо раствора АфВ1 добавляли такой же объем дистиллированной воды.
Воздействие АфВ1 на люминесценцию светящихся бактерий оценивали по величине биолюминесцентного индекса, определяемого, как отношение интенсивности свечения бактерий в опытных культурах, содержащих токсин (/аф), к интенсивности люминесценции бактерий в контрольных культурах без токсина (1к). Принято считать, что изменения люминесценции не являются значимыми при биолюминесцентном индексе, соответствующем интервалу 0.8—1.2 [13].
Оценка дезактивации АфB1 под действием нано-алмазов. В экспериментах использовали модифицированные наноалмазы (МНА), обладающие высокой коллоидной устойчивостью в дисперсионных средах и адаптированные для медико-биологических исследований [19]. Гидрозоли МНА с концентрацией 1—1.5 мас. % готовили добавлением дистиллированной воды к навеске порошка наночастиц. Гидрозоль МНА вносили в образцы АфВ1, суспензию перемешивали в течение 10 с на вортексе (Vortex-Genie 2g-560E, "Scientific Industries, Inc", США), инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре и собирали частицы центрифугированием (MiniSpin plus centrifuge, "Eppendorf", Германия) при 14100 g в течение 10 мин. Для более полного удаления наночастиц использовали их свойство к коагуляции, поэтому перед центрифугированием в образцы добавляли NaCl до концентрации 80—100 мМ. Количество остаточного (неадсорбированный нано-частицами) микотоксина в полученных суперна-тантах оценивали по данным их спектрального анализа, проводимого в диапазоне 200—500 нм [20] с помощью спектрофотометра UVIKON 943.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние АфВ1 на рост и биолюминесценцию бактерий. В ходе исследований было установлено, что АфВ1 обладает разнонаправленным эффектом действия на биолюминесценцию изучаемых видов бактерий — ингибирует люминесценцию P. phosphoreum и активирует светоизлучение E. coli как в случае использования бактериальных клеток, восстановленных после лиофилизации, так и клеток свежих культур. При этом величина наблюдаемого эффекта зависела от концентрации микотоксина. Показано, что активация люминесценции восстановленных клеток E.coli (бактерии из препарата Микробиосенсор ЕСК) более выражена при малых концентрациях АфВ1 и снижается при повышении концентрации токсина (рис. 1). В отличие от E. coli, достоверное ингибирование светоизлу-чения восстановленных после лиофилизации клеток P. phosphoreum (бактерии из препарата Микробиосенсор B17-677F) наблюдается при значительно больших концентрациях АфВ1 (рис. 1). Надо заметить, что аналогичные различия в чувствительности к действию АфВ1 отмечаются и у свеже-
Отн. ед. (а) (б) (в)
мкг/мл
Рис. 1. Биолюминесценция (/аф//к) бактерий, восстановленных после лиофилизации (а, б), и клеток свежевыращен-ных культур (в) при инкубации с разными концентрациями АфВ1 (мкг/мл): I - Микробиосенсор ЕСК, II — Микро-биосенсор B17-677F, III — E.coli Z905/pPHL7, IV — P. phosphoreum 1883. Линиями ограничен интервал, в котором изменения биолюминесценции не являются достоверными.
Рис. 2. Рост (1) и люминесценция (2) бактерий в присутствии АфВ1 (мкг/мл): а — 0.005, б — 0.05, в — 0.1, г — 0.15. (а-в) - P. phosphoreum 1883, (г) - E. coli Z905/pPHL7.
выращенных бактерий изучаемых видов. Ингиби-рование люминесценции свежевыращенных культур P. phosphoreum наблюдалось при еще более высоких концентрациях АфВ1 по сравнению с бактериями, восстановленными после лиофили-зации, в то время как активация светоизлучения интактных клеток E. coli достигалась при меньших концентрациях микотоксина.
Так как интенсивность свечения является интегральным показателем воздей
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.