МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 5, с. 630-638
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.28.017.7
Са2+-ЗАВИСИМАЯ МОДУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКАМ У STREPTOMYCES LIVIDANS 66 И STREPTOMYCES COELICOLOR A3(2)
© 2008 г. О. Б. Беккер*, С. М. Елизаров**, М. Т. Алексеева***, И. К. Любимова*, В. Н. Даниленко*
*Институт общей генетики им. Н И. Вавилова РАН, Москва **Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, Москва ***Научно-исследовательский центр "БИОАН", Москва Поступила в редакцию 14.08.2007 г.
Показано, что уровень устойчивости к антибиотикам различной химической природы у актинобактерий рода Streptomyces регулируется ионами Са2+. Установлено, что ингибиторы Са2+/кальмодулина и Са2+/фосфолипид-зависимых серин-треониновых протеинкиназ (СТПК) понижают устойчивость актинобактерий к антибиотикам. Исследовано влияние Са2+-зависимого фосфорилирования на активность энзиматической аминогликозидфосфотрансферазной системы защиты актинобактерий от аминогли-козидных антибиотиков. Показано, что ингибиторы Са2+/кальмодулина и Са2+/фосфолипид-зависимых СТПК снижают стимулированную Са2+ устойчивость к канамицину клеток Streptomyces lividans, трансформированных гибридной плазмидой, имеющей в своем составе ген энзима аминогликозидфосфо-трансферазы VIII (APHVIII). В клетках S. coelicolor А3(2) идентифицирована протеинкиназа РК25, фос-форилирующая APHVIII фермент in vitro. Предполагается, что СТПК играют существенную роль в регуляции устойчивости к антибиотикам у актинобактерий.
Ключевые слова: серин-треониновые протеинкиназы, множественная лекарственная устойчивость, актинобактерии, аминогликозидфосфотрансфераза VIII.
Биохимические и физиологические исследования показывают, что ионы кальция в клетках бактерий вовлечены в регуляцию таких процессов, как клеточный цикл, патогенез, подвижность и хемотаксис, стабилизация и обеспечение целостности наружного липополисахаридного слоя и клеточной стенки бактерий, стабилизация бактериальных белков, изменение их энзиматической активности, а также активация или подавление фосфорилирования белков протеинкиназами [1, 2]. Ионы Са2+ служат регуляторами секреторных процессов, влияя на экспрессию поринов наружной мембраны в ответ на изменение осмотических характеристик среды [1]. В недавних обзорах [1, 2] обобщены данные о роли Са2+ во многих процессах у актинобактерий, включая процессы дифференцировки межклеточной коммуникации и передачи сигналов. Поэтому исследование Са2+-зависимых регуляторных белков представляется необходимым инструментом для изучения роли Са2+ в бактериях.
Актиномицеты рода Streptomyces - почвенные, мицелиальные, грамположительные бактерии, являются продуцентами ряда биологически активных веществ, включая около 70% антибиотиков, используемых в медицине и ветеринарии [3]. Проду-
1 Адресат для корреспонденции: (e-mail: valerid@rutenia.ru).
цируя антибиотики различной химической природы, актиномицеты выработали механизмы защиты от них. Кластер генов, ответственный за биосинтез антибиотика, как правило, содержит от одного до нескольких генов устойчивости к нему [4]. Устойчивость к антибиотикам продуцентов, так же как и клинических изолятов патогенных бактерий обусловлена многими механизмами. Так, механизм устойчивости продуцентов к аминогликозидам обусловлен их энзиматической инактивацией амино-гликозидфосфотрансферазами [5].
Генетическая детерминация устойчивости была подтверждена получением мутантов S. coeli-color A3 (2), чувствительных к различным антибиотикам, и картированием генов устойчивости этого организма [6]. Один из таких генов - aphVШ, кодирующий фермент аминогликозидфосфотрансфе-разу VIII у S. rimosus, был клонирован в S. lividans [7]. Структурно-функциональная характеристика APHVIII фермента позволила отнести его к новой группе аминогликозидкиназ [8], отличных от аналогичных ферментов у продуцентов аминоглико-зидных антибиотиков.
Известно, что актиномицеты обладают устойчивостью не только к собственному антибиотику, но и ко многим другим [6]. Недавно показано, что 480 ис-
следованных почвенных изолятов актиномицетов характеризуются множественной устойчивостью к антибиотикам, в том числе новым, применение которых в клинике только начинается [9]. Авторы предложили название феномену множественной лекарственной устойчивости актиномицетов - ре-зистома. Этот термин обозначает объединение всех генов устойчивости, экспрессируемых и неэкспрес-сируемых (молчащих в лабораторных условиях) в патогенных и непатогенных бактериях [10]. Учитывая критическую ситуацию в клинике, обусловленную множественной лекарственной устойчивостью [11], и значение актинобактерий как резервуара генов устойчивости, резистома может стать ключевым объектом для изучения и решения этой проблемы.
Анализ доступных баз данных о геномах актинобактерий рода Streptomyces позволяет сделать заключение о перспективности стрептомицетов как объекта для выявления и характеристики новых механизмов устойчивости к антибиотикам. Учитывая важную роль Са2+ как вторичного мессенджера у бактерий [1, 2], представлялось целесообразным уделить особое внимание Са2+-зависимым путям передачи сигналов.
Целью настоящего исследования являлось изучение влияния Са2+ на регуляцию уровня устойчивости к антибиотикам, опосредованную серин-треониновыми протеинкиназами исследуемых штаммов Streptomyces.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы, среды и условия культивирования.
Объектами исследования были наиболее генетически изученные близкородственные виды актиномицетов: Streptomyces lividans 66 и Streptomyces coelicolor A3(2) [12, 13] (ВКПМ, Москва). Бактерии выращивали на полноценной агаризованной среде YSP [12]. Для тестирования антибиотико-устойчивости штаммов на чашках Петри использовали агаризованную среду МГ следующего состава (%): 0.5 мальтэкстракта ("Sigma"), 0.4 дрожжевого экстракта ("Difco"), 0.05 NaCl, 0.05 MgSO4, 0.05 K2HPO4, 0.0001 FeSO4, 0.1 KNO3, 2 глюкозы, pH 7.5.
Клетки S. coelicolor A3(2) для анализа фосфори-лирования белков выращивали в жидкой питательной среде, содержащей (%): 4 глюкозы, 0.2 бакто-пептона, 0.2 дрожжевого экстракта, 0.2 сульфата аммония, 0.05 MgSO4, 0.05 K2HPO4, рН 7.0 при 28°С в течение 48 ч (ранняя стационарная фаза) в присутствии 20 мМ Са2+ или без него. Мицелий собирали центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.
Клетки Escherichia coli BL21 (Novagen) культивировали при 37°С согласно Майерендорф и со-авт. [14]. Конструирование плазмид и экспрессию
в Е. coli конструкта aphVIII, содержащего дополнительно кодирующую последовательность для декапептида His10, прилегающего к N-концу молекулы APHVIII, проводили, как описано ранее [8].
Определение чувствительности к антибиотикам. Тест основан на определении зоны подавления роста штамма Streptomyces, засеянного газоном на агаризованной среде, вокруг бумажных дисков, содержащих антибиотик или антибиотик в сочетании с ингибиторами или активаторами СТПК.
Споровую суспензию, полученную путем смыва с газона стрептомицета на агаризованной полноценной среде и пропущенную через ватный фильтр, смешивали с агаризованной МГ средой (0.7%) с Са2+ (10 мМ) или без Са2+. Аликвотой смеси засевали чашки с агаризованной средой МГ (2%) в количестве 1 х 107 спор на чашку. На поверхность агара накладывали бумажные диски, содержащие антибиотик или исследуемое вещество. Культуры инкубировали в течение 24 ч при 28°С. Тестирование осуществляли в субингибирующих концентрациях. Обычно их значения составляли не более 50% от минимальной ингибирующей концентрации.
Модуляторы активности СТПК и связывающих кальций белков. Использовали коммерческие препараты фирм "Sigma" и "Calbiochem": бис-индолил-малеимид-1 (100 нмоль/диск), бис-индолилмалеи-мид-5 (100 нмоль/диск), верапамил (100 нмоль/диск), прениламин (100 нмоль/диск), хлорпромазин (100 нмоль/диск), дибутирил-цАМФ (1 мкмоль/диск), форсколин (1 мкмоль/диск), дихлоробензимида-золрибозид (1 мкмоль/диск).
Антибиотики. Дпя работы использовали бумажные диски с антибиотиками: стрептомицин (10 мкг/диск), тобрамицин (10 мкг/диск), гентамицин (10 мкг/диск), канамицин (30 мкг/диск), амикацин (30 мкг/диск), эритромицин (15 мкг/диск), олеандо-мицин (15 мкг/диск), клиндамицин (2 мкг/диск), ази-тромицин (15 мкг/диск), линкомицин (15 мкг/диск), тетрациклин (30 мкг/диск), хлорамфеникол (30 мкг/диск), рифампицин (5 мкг/диск), олигомицин (5 мкг/диск).
Базы данных. Обобщение результатов проводили по базе данных для генома S. coelicolor: http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_coelicolor/
Получение экстрактов клеток. Oтмытый от среды мицелий актинобактерий ресуспендировали в буфере А (50 мМ трис-НС1, 125 мМ NaCl, 1 мМ СаС12, 5 мМ MgCl2, 10% глицерин, 1 мМ фенилме-тилсульфонилфторид (ФМСФ), 0.5 мМ ДТТ, 150 мМ ß-глицерофосфат, 100 мМ NaF, леупептин и пепста-тин - по 1 мкг/мл каждого, рН 7.8, после чего разрушали клетки двукратным "озвучиванием" в отечественном ультразвуковом дезинтеграторе (УЗДН-1, У-42) в течение 5 мин при частоте 25 кГц. Суспензии инкубировали 15 мин при 4°С в присутствии (по 25 мкг/мл) панкреатических РНКазы и ДНКазы и затем удаляли клеточный дебрис центрифугиро-
ванием при 20000 g в течение 30 мин. Супернатанты использовали для выделения СТПК.
Клетки Е. coli разрушали двукратным "озвучиванием" в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7.8, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ ФМСФ, в ультразвуковом дезинтеграторе в течение 1 мин при частоте 15 кГц. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Растворимые белки в супернатанте анализировали SDS-PAGE согласно Лэммли [15]. Наличие в клетках клонов дополнительного полипептида с молекулярной массой 31.5 кДа (His10-APHVIII) указывало на экспрессию aphVIII. Клоны с высоким содержанием растворимого APHVIII использовали для его выделения в нативном виде. В этом случае клетки Е. coli ресуспендировали в буфере Б (50 мМ Na-фосфат, рН 8.0, 300 мМ NaCl, 1 мМ ФМСФ, 10% глицерина) и разрушали двукратным "озвучиванием", как описано выше. Лизат инкубировали с нуклеазами и клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Из супернатанта выделяли His10-APHVIII.
Выделение протеинкиназ. Для
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.