ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 5, с. 602-608
УДК 577.1:632.938.1
САЛИЦИЛОВАЯ И ЖАСМОНОВАЯ КИСЛОТЫ В РЕГУЛЯЦИИ ПРО-АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ЛИСТЬЕВ ПШЕНИЦЫ ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ Septoria nodorum Berk.
© 2011 г. Л. Г. Яруллина, Н. Б. Трошина, Е. А. Черепанова, Е. А. Заикина, И. В. Максимов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа, 450054
e-mail: yarullina@bk.ru Поступила в редакцию 09.12.2010 г.
Исследовано влияние медиаторов сигнальных систем салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот и их смеси на образование АФК (супероксидного радикала O' и Н2О2), активность оксидоре-дуктаз (оксалатоксидазы, пероксидазы, каталазы) в листьях пшеницы Triticum aestivum L., инфицированных возбудителем септориоза Septoria nodorum Berk. Предпосевная обработка семян СК и ЖК снижала степень развития гриба на листьях пшеницы. СК оказывала более ранний индуцирующий
эффект на синтез O' и Н2О2 по сравнению с ЖК. Защитное действие салициловой и жасмоновой кислот против возбудителя септориоза было обусловлено активацией оксалатоксидазы, индукцией анионных и катионных пероксидаз и снижением активности каталазы. Способность соединений стимулировать образование АФК в растительных тканях можно использовать в качестве критерия для оценки иммуномодулирующей активности новых средств защиты растений.
Индукция защитного ответа в растениях против патогенов осуществляется с помощью различных сигнальных систем [1]. Известными их медиаторами являются салициловая (СК) и жасмоновая (ЖК) кислоты [2, 3]. Доказано, что СК, как интер-медиат НАДФН-оксидазной системы, стимулирует защитные реакции растений против болезней, вызываемых биотрофными патогенами, посредством индуцирования в них компонентов системно-приобретенной устойчивости (СПУ), в том числе регуляции активности ферментов про-анти-оксидантной системы, накопления фенольных соединений, укрепления клеточной стенки в зоне инфицирования за счет отложения лигнина [4, 5]. В отношении ЖК—интермедиата липоксиге-назной сигнальной системы, показано, что в обработанных ею растениях в ответ на поранение насекомыми-вредителями и некротрофную инфекцию индуцируется системная индуцированная устойчивость (СИУ), компонентами которой являются активация ингибиторов протеиназ и ферментов антиоксидантной защиты [6]. Поскольку в некоторых случаях тип питания у возбудителей грибных болезней бывает смешанным (гемибиотрофы), как у Septoria nodorum Berk., то представляет значительный интерес выяснение роли СК и ЖК в таких системах.
Ранее нами была выявлена важная роль оксалатоксидазы в генерации Н2О2 и формировании защитного ответа растений пшеницы к грибным патогенам [7]. Ее активация и сопряженная генерация Н2О2 под воздействием СК и хитоолигоса-харидов повышали устойчивость пшеницы к возбудителям твердой головни и корневой гнили
[8, 9]. Предобработка растений интермедиатами сигнальных систем и их смесями с элиситорами весьма перспективна в сельском хозяйстве для защиты растений, поскольку такие компоненты эффективны даже в наномолярных концентрациях [10]. Однако для создания подобных препаратов необходимы новые сведения о механизмах индуцирования сигнальными молекулами устойчивости к патогенам при участии про-антиокси-дантной системы растений, поскольку в некоторых случаях они могут обладать супрессорным эффектом на иммунную систему растений.
Цель работы — изучение образования различных форм АФК, изменений активности оксалат-оксидазы, каталазы, изоферментного спектра пероксидазы в связи с формированием устойчивости растений пшеницы к грибу Septoria nodorum Berk. под воздействием салициловой и жасмоно-вой кислот, а также их смеси.
МЕТОДИКА
Объект исследования. Опыты проводили на отрезках листьев Triticum aestivum L. сорта Башкирская 24, выращенной из предобработанных (3 ч) растворами 10-6 М салициловой (ч.д.а., "Реахим", Россия) и 10-7 М жасмоновой (ч.д.а., "Реахим", Россия), а также их смесью (1 : 1). Семена проращивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Полностью развернутые листья 7 сут проростков срезали, помещали во влажную камеру на фильтровальную бумагу, срезы прикрывали ватой, смоченной в растворе бензимидазола (40 мг/л) [11]. Отрезки листьев инокулировали суспензией
пикноспор S. nodorum Berk. (106 спор/мл), которые были выделены авторами из местной популяции гриба. Инокулированные листья выдерживали при комнатной температуре в темноте в течение 24 ч, после чего переносили на искусственное освещение с фотопериодом 16 ч/сут. Интенсивность развития гриба на эпидермисе листьев оценивали через 24 ч, генерацию H2O2 в мезофилле листьев — через 48 ч, интенсивность симптомов болезни — через 72 ч после инокуляции. В качестве контроля использовали неинфицированные и инфицированные листья растений, не обработанные СК и ЖК.
Определение H2O2 и O2. Отрезки листьев гомогенизировали в 0.025 М фосфатном буфере, pH 6.2 (ФБ), в соотношении 1:3, центрифугировали 20 мин при 10000 g на центрифуге фирмы "Eppendorf" (Германия). Супернатант использовали для
определения содержания H2O2 и O2-. Концентрацию O определяли при длине волны 530 нм с использованием 0.6 мМ нитротетразолия синего (НТС) фирмы "Sigma" (США). Коэффициент молярного поглощения формазана, образовавшегося при восстановлении НТС супероксидным радикалом, принимали равным 15000 М-1 см-1 [12]. Содержание Н2О2 оценивали при 560 нм с использованием ксиленолового оранжевого [13]. Реагент содержал 0.074% соли Мора в 5.81% серной кислоте и 0.009% ксиленолового оранжевого в 1.82% сорбита (в соотношении 1 : 100). Оптическую плотность продуктов реакции измеряли на спектрофотометре Biospek-Mini фирмы "Shimadzu" (Япония).
Интенсивность образования Н2О2 оценивали также на гистологических срезах по окислению 3,3-диаминобензидина (ДАБ) по методу, изложенному в работе [14]. Синтез H2O2 оценивали по количеству окрашенных клеток через 48 ч после инокуляции.
Активность оксалатоксидазы (КФ 1.2.3.4). Цито-плазматическую (свободнорастворимую) фракцию фермента выделяли с использованием 0.05 М сук-цинатного буфера, pH 3.8 (СБ) [15]. Для этого отрезки листьев гомогенизировали в СБ при соотношении массы навески листьев к объему СБ (1 : 3). Экстракт центрифугировали 20 мин при 12000 g ("Eppendorf", Германия). Реакционная смесь для определения активности оксалатоксидазы содержала 100 мкл СБ, 0.0025 М щавелевую кислоту ("Ре-ахим", Россия), 50 мкл ферментной вытяжки и коммерческой пероксидазы хрена фирмы ("ДиаэМ", Россия) в концентрации 15 ед./мл и 0.08%-ный хромогенный субстрат о-фенилендиамин (ОФД, "Реахим", Россия).
Активность каталазы (КФ 1.11.1.6). Растительную ткань растирали в 50 мМ растворе ФБ, рН 7.8. Отношение массы навески к объему буфера ФБ 1: 10. После центрифугирования 25 мин при 12000 g на центрифуге 5415К ("Eppendorf", Германия) су-пернатант использовали для анализа активности фермента. Реакцию инициировали добавлением 0.1мл супернатанта к 2 мл 0.03%-ного раствора
Н2О2. В контрольную пробу вместо супернатанта вносили 0.1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливали через 10 мин добавлением 1 мл 4%-ного молибдата аммония. Интенсивность развившейся окраски измеряли на спектрофотометре ("Shimadzu", Япония) при длине волны 410 нм против контрольной пробы.
Активность каталазы рассчитывали по формуле: E = (Ак—Ао) VtK, где Е—активность каталазы (мкМ Н2О2/мг белка мин), Ак и Ао — поглощение контрольной и опытной проб соответственно, V — объем вносимой пробы, 0.1 мл, t — время инкубации, 600 с, К — коэффициент миллимолярного поглощения Н2О2, равный 22.2 х 103 мМ-1 см-1.
Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7). Для выделения цитоплазматической фракции перокси-дазы отрезки листьев гомогенизировали в 0.01 М №-фосфатном буфере, рН 6.2 (ФБ). Отношение массы навески листьев к объему ФБ 1 : 3. Экстракт центрифугировали 25 мин при 12000 g на центрифуге 5415К ("Eppendorf", Германия). Су-пернатант использовали для анализа активности пероксидазы. Активность фермента определяли по окислению 0.15%-ного ОФД в присутствии 0.0015% Н2О2 в 0.01 М ФБ.
Оптическую плотность окисленного ОФД при определении оксалатоксидазы и пероксидазы оценивали при 490 нм на приборе для иммуно-ферментного анализа Benchmark Microplate Reader ("BioRad", США). Единица активности фермента соответствовала количеству окисленного субстрата, вызывающему увеличение единицы оптической плотности АЛ за 1 мин. Для сравнительного анализа активность выражали в отн. ед. на 1 г сырой мыссы.
Изоферментный спектр пероксидазы. Изоэлек-трофокусирование (ИЭФ) белковых экстрактов проводили на приборе фирмы "Хийу-Каллур" (Эстония) с использованием 7%-ного полиакрила-мидного геля (ПААГ) и 2.5% изолитов фирмы "MP Biomedicals" (США). Перед нанесением на гель образцы выравнивали по содержанию белка и диа-лизовали против дистиллированной воды. Активность изопероксидаз в геле выявляли 0.01%-ным раствором 3,3-диаминобензидина солянокислого с 0.005% H2O2 в 0.1 М ФБ. После проявления ферментативной активности гели анализировали с использованием сканера ("Genius", США). Определение pI пероксидаз пшеницы проводили с использованием диагностических наборов белков с диапазоном pI от 3.5 до 10.6 ("Sigma", США).
Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3 биологических повторах. В каждом варианте опыта фиксировали по 10 листьев. На рисунках приведены средние результаты опыта и их стандартные ошибки.
II
" 1
III
Рис. 1. Влияние салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот и их смеси на интенсивность прорастания спор (I), генерацию Н2О2 в клетках мезофилла в зоне инфицирования (II) и развитие симптомов септориоза (III) в листьях пшеницы: а — контроль, б — обработка СК; в — обработка ЖК, г — обработка смесью СК + ЖК. I, II, III — 24, 48 и 72 ч после инокуляции соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние СК и ЖК на развитие гриба тЛагпш на листьях пшеницы. Наблюдение за ростом возбудителя септориоза на эпидермисе листьев показало, что в контроле уже через 24 ч после инокуляции мицелий гриба густо покрывал поверхность листа (рис. 1а, I). В вариантах опыта с применением СК, ЖК и и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.