ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 4, с. 312-319
ЦИТОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 57.034:577.217.5+57.085.23
САМОСИНХРОНИЗАЦИЯ РИТМА СИНТЕЗА БЕЛКА В КУЛЬТУРАХ HaCaT
КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА1
© 2011 г. В. Я. Бродский, В. В. Терских, А. В. Васильев, Н. Д. Звездина, Е. А. Воротеляк,
В. И. Фатеева, Л. А. Мальченко
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: brodsky.idb@bk.ru Поступила в редакцию: 31.05.10 Окончательный вариант получен: 17.06.10
В культурах кератиноцитов человека HaCaT, содержащихся в бессывороточной среде на стеклах, обнаружен околочасовой ритм синтеза белка, сходный с ритмом в гепатоцитах in vitro. Интенсивность синтеза определяли по включению 3Н-лейцина с поправкой на пул свободного меченого лейцина. Ритм изучали в отмытых 1- или 2-суточных культурах после смены среды. Среда, кондиционированная кератиноцитами HaCaT, синхронизировала разреженные несинхронные в контроле культуры гепатоцитов. Следовательно, кератиноциты выделяют в среду синхронизирующие факторы. Хелатор ионов кальция ВАРТА-АМ ликвидирует ритм синтеза белка как в плотных синхронных в контроле культурах гепатоцитов, так и в культурах кератиноцитов HaCaT. Аналогичным был эффект ингибитора протеинкиназ Н7. Таким образом, в кератиноцитах, как и в гепатоцитах, происходит самосинхронизация колебаний интенсивности синтеза белка. Механизм самосинхронизации — кальций-зависимое фосфорилирование клеточных белков.
Ключевые слова: прямые межклеточные взаимодействия, ритм синтеза белка, фосфорилирование белков, околочасовые ритмы, кератиноциты, гепатоциты, клеточные культуры, ганглиозиды, мела-тонин
ВВЕДЕНИЕ
Ранее нами выявлен механизм кооперации гепатоцитов in vitro и in vivo в формировании ритма синтеза белка (обзор: Brodsky, 2006). Ритм использовали как маркер прямых межклеточных взаимодействий, приводящих к самосинхронизации колебаний интенсивности синтеза белка. Сигнальными факторами, взаимодействующими с рецепторами клеточной мембраны и запускающими цепь процессов в цитоплазме, в наших опытах были ганглиозиды и трансмиттеры — норадрена-лин и серотонин, а также мелатонин. Как мишень действия сигнала определили внутриклеточный кальций, а ключевым процессом организации ритма синтеза белка оказалась активация протеинки-наз и, соответственно, фосфорилирование белков. Возник вопрос: только ли гепатоцитам свойственен протеинкиназный механизм организации ритма синтеза белка в клеточных популяциях?
Изучали перевиваемую культуру HaCaT кератиноцитов человека (Boucamp et al., 1988). HaCaT — линия иммортализованных клеток, не обладающих туморогенностью и инвазивностью. Взаимо-
1 Авторы благодарят РФФИ за поддержку (проекты 09-04-
00116, 08-04-00144, 09-04-12132).
действуют ли кератиноциты друг с другом, синхронизируя колебания синтеза белка, т.е. свойственен ли им общий популяционный ритм синтеза? При положительном ответе, каков механизм межклеточной кооперации: влияет ли на кинетику синтеза белка в кератиноцитах НаСаТ блокада изменений цитоплазматического кальция и ингибирова-ние протеинкиназ, как это наблюдали в культурах гепатоцитов?
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры. Линия HaCaT кератиноцитов кожи человека выделена более 20 лет назад (Boucamp et al., 1988). Клетки культивировали в среде DMEM (ПанЭко) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и глутамина (ПанЭКО), снимали смесью 0.25% трипсин-ЭДТА (Gibco). Пассировали раз в 3—5 дней в соотношении 1 : 4—1 : 6. Для целей наших опытов суспензию клеток переносили в бессывороточную среду (Бродский, Терских и др., 1996): среда 199 с 0.2 мг/мл альбумина для клеточных культур (Sigma) и 0.5 мкг/мл инсулина (Sigma); газовая фаза содержала 95% воздуха и 5% СО2. Суспензию, содержащую 4—5 х 106 клеток в 1 мл среды, вносили
в чашку Петри с 30 мл среды над стеклами, покрытыми коллагеном. Площадь каждого стекла примерно 1 см2 . Получали плотные культуры с близко расположенными клетками (рис. 1). Через сутки культуры отмывали и переносили в свежую среду.
Исследование кинетики синтеза белка. Пробы, по три стекла с культурами каждая, брали последовательно через 10 мин в течение 2—3 ч. Каждую пробу инкубировали отдельно в течение 10 мин при 37°C в среде с 3Н-лейцином (25—30 мкО/мл, специфическая радиоактивность 70—100 Ci/ммоль). Культуры промывали холодной средой и для экстракции не включившегося в белки лейцина переносили в холодную 5% хлорную кислоту на 60 мин. Затем культуры промывали этиловым спиртом и белки растворяли гиамином (бензетониум гидроксид, Sigma). Радиоактивность лейцина в белках и в небелковой кислоторастворимой фракции измеряли в каждой культуре (на отдельном стекле), используя сцин-тилляционный счетчик TRJ-CARB, модель 2810-TR фирмы Perkin Eimes. Рассчитывали относительное включение лейцина Icorr в белки с поправкой на пул свободного лейцина
Icorr = I Х Pm/Pi (cpm),
где I — измеренное включение в определенной культуре, а P = I + p — общая радиоактивность клеток культуры, p — радиоактивность свободного (не включившегося в белки) 3Н-лейцина в той же культуре, Pm — средняя радиоактивность всех культур данного опыта. В отношении Icorr нивелируются вариабельность пула свободного лейцина, а также различное число клеток в разных культурах. Детальнее метод изложен ранее (Brodsky et al., 1992, 2000).
Каждый опыт ставили на культурах, полученных из одной и той же суспензии клеток HaCaT Условия использования ингибиторов отмечены при описании соответствующих опытов в тексте и подробнее в подписях к рисункам.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В культурах клеток HaCaT обнаружен ритм синтеза белка (рис. 2). В течение 160 мин обнаружены три периода колебаний интенсивности синтеза, нерегулярные, как обычно в околочасовых ритмах (обзор: Brodsky, 2006). Примечательное отличие клеток HaCaT от гепатоцитов in vitro — в огромном пуле не включившегося в белки 3Н-лей-цина. В гепатоцитах радиоактивность пула свободного лейцина обычно 2—3 раза больше радиоактивности белков; иногда эти величины даже равны. В клетках HaCaT это отношение 12—15, т.е. относительное (к свободному пулу) включение лейцина в белки в этих клетках значительно ниже, чем в гепатоцитах. Основной вывод опыта рис. 2: клетки HaCaT самосинхронизируются в свежей
Рис. 1. Культура кератиноцитов человека (линия НаСаТ).
бессывороточной среде и в результате формируется общий популяционный ритм синтеза белка.
Синхронизация активности клеток в пределах популяции может быть дистантной через среду или же прямой через клеточные контакты. В опи-
Icorr
0 30 60 90 120 150
Время, мин
Рис. 2. Кинетика синтеза белка в суточных культурах кератиноцитов человека НаСаТ. Суточные культуры отмывали и переносили в свежую бессывороточную среду. Через 30 мин, не меняя среду, каждые 10 мин брали пробы по 3 культуры и в течение 160 мин в каждой культуре отдельно исследовали кинетику синтеза белка; 1согг (срт) — включение 3Н-лейцина с поправкой на пул лейцина, не включившегося в белки (см. Методы). Прямая линия (здесь и на графиках рис. 3 и 4) — средний уровень синтеза белка для всех культур данного опыта, пунктир — ошибка этой средней.
1еогг 110
80
50
60
120 0
60
120
Время, мин
Рис. 3. Кинетика синтеза белка в суточных разреженных культурах гепатоцитов в свежей среде и в таких же культурах, содержавшихся в среде, кондиционированной кератиноцитами НаСаТ Получение кондиционированной среды: суточные культуры НаСаТ содержали в бессывороточной среде 20 часов, затем собрали среду, отцентрифугировали 3 мин при 1500g и налили в чашку с разреженными (в контроле несинхронными) культурами гепатоцитов: а — контроль, культуры гепатоцитов отмыли, перенесли в свежую среду и через 15 мин в течение следующих 120 мин исследовали кинетику синтеза белка; б — такие же культуры из той же суспензии гепатоцитов после отмывки перенесли в среду, кондиционированную НаСаТ, и в этой среде в культурах исследовали кинетику синтеза белка.
санных нами межклеточных взаимодействиях в культурах гепатоцитов клетки выделяют в среду ганглиозиды, которые воспринимаются другими клетками той же популяции. Включается цепь процессов, приводящих к согласованной синхронной активности клеток. Другой возможный вариант межклеточных взаимодействий в плотном эпителиальном монослое — нерецепторный, путем перехода из клетки в клетку некоторого синхронизатора, который включает ту же или иную цепь процессов, приводящих к синхронизации клеток. Распространяющиеся через щелевые контакты волны кальция давно и хорошо описаны, но их влияние на какие-либо тканевые функции и, тем более, их синхронность пока не изучены.
Выделяют ли клетки НаСаТ некие факторы, синхронизирующие ритм синтеза белка?
Ранее мы исследовали два типа культур гепатоцитов (Бродский и др., 1997; Вгоё8ку е! а1., 2000). Плотные культуры с близко расположенными клетками быстро самосинхронизируются, что обосновывается обнаружением в них ритма синтеза белка практически сразу же после смены среды. В разреженных культурах с далеко отстоящими друг от друга клетками ритм долго не выявляется, т.е. такие культуры исходно не синхронны. В среде, кондиционированной плотными культурами, в разреженных культурах сразу выявлялся ритм синтеза белка. К тому же эффекту приводило добавление в свежую среду с разреженными культурами ганглиозидов или норадреналина, серотонина, ме-
латонина (см. также Бродский и др., 2006, 2008; Звездина и др., 2008).
Как и во всех предыдущих наших работах (ссылки выше), в отмытых суточных разреженных культурах гепатоцитов через 15 мин после смены среды ритм синтеза белка не был обнаружен (рис. 3). Если такие же культуры перенести после отмывания в среду, кондиционированную 20 часов кератиноцитами НаСаТ, в разреженных культурах гепатоцитов выявляется четкий ритм синтеза белка. Следовательно, кератиноциты выделяют в среду фактор (или факторы), синхронизирующий ритм синтеза белка.
Каков механизм синхронизации кератиноци-тов при формировании общего популяционного ритма синтеза белка?
Как уже отмечалось, в культуре гепатоцитов эндогенным синхронизирующим сигнальным фактором являются ганглиозиды (Бро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.