ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 11, с. 1575-1584
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 575.22:585.579.2
САМОСТОЯТЕЛЬНОСТЬ ВИДОВ Iris vorobievii N.S. Pavlova, Iris mandshuriea Maxim. И Iris humilis Georgi (Iridaeeae): ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИЗ ЯДЕРНОГО И ХЛОРОПЛАСТНОГО ГЕНОМОВ
© 2009 г. M. М. Козыренко, Е. В. Артшкова, Ю. Н. Журавлев
Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток 690022; е-mail: kozyrenko@biosoil.ru Поступила в редакцию 08.12.2008 г.
С использованием молекулярных маркеров ДНК - ядерных (RAPD) и хлоропластных (trnH-psbA, atpB-rbcL, rps4, trnL-trnF, trnS-trnG) проведено исследование популяций близкородственных видов рода Iris L. - Iris vorobievii N.S. Pavlova, I. mandshurica Maxim, и I. humilis Georgi. Ha основе 243 RAPD-фрагментов рассчитаны основные популяционные параметры и выявлены видоспецифичные RAPD-маркеры. Во всех регионах хпДНК, кроме trnL-trnF, обнаружены различия, дифференцирующие виды. Общая длина последовательностей четырех вариабельных регионов хпДНК, включая индели, составила 3640 пн. Изменчивость этих регионов низкая - 22 вариабельных сайта (0.63%), из них 13 информативны согласно методу максимальной парсимонии и 9 - неинформативны. Анализ распределения суммарной генетической изменчивости (AMOVA) показал значимый (р < 0.0001) высокий уровень дифференциации как ядерного (FST = 0.681), так и хлоропластного (FST = 0.854) геномов между исследуемыми выборками ирисов. Таким образом, использование мультигенного подхода позволило подтвердить видовую самостоятельность I. vorobievii, I. mandshurica и I. humilis и сделать вывод об отсутствии I. humilis во флоре Приморского края и наличии видов I. vorobievii и I. mandshurica.
Во флоре российского Дальнего Востока род Iris L. - самый крупный и сложный в семействе Iridaceae, представлен одиннадцатью видами [l, 2]. До сих пор нет единого мнения о научных названиях и видовом разнообразии ирисов Приморского края. В первую очередь это касается близкородственных видов Iris vorobievii N.S. Pavlova и I. humilis Georgi (синоним I. mandshurica Maxim.), которые относятся к секции Psammiris (Spach) Taylor. В России известна лишь одна популяция I. vorobievii в Приморском крае (крайний юг Ха-санского р-на), а I. humilis (I. mandshurica) встречается редко (Октябрьский, Партизанский, Уссурийский р-ны) [l-З]. Ранее I. vorobievii ошибочно принимали то за I. bloudowii Ledeb., то за I. mandshurica Maxim. или I. flavissima Pall. (синоним I. humilis Georgi) [l], и в настоящее время не все ботаники признают видовую самостоятельность этого таксона [2]. Причиной такой таксономической неопределенности ирисов является отсутствие надежных морфологических диагностических признаков, что связано с высоким уровнем гомопла-зии, чрезвычайным разнообразием морфоэколо-гических характеристик и многочисленными хромосомными вариациями. Недавно [3] при исследовании микроструктуры поверхности семенной кожуры близкородственных видов I. humilis, I. mandshurica и I. vorobievii обнаружены новые признаки, которые снова поднимают вопрос о самостоятельности этих таксонов.
В последние десятилетия для уточнения спорных вопросов систематики, популяционной и видовой идентификации, изучения филогении таксонов растений широко применяют высокоразрешающие методы молекулярного маркирования, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Предполагаемые филогенетические отношения 18 таксонов рода Iris серии Californicae были реконструированы на основе изменчивости последовательностей внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) ядерной рибосомной ДНК [4]. Внутривидовая вариабельность хлоропластного генома (хпДНК), как правило, невысока, но меньший эффективный размер популяции и наследование от одного из родителей делают хпДНК-маркеры перспективными для изучения филогенетических взаимоотношений ирисов на разных таксономических уровнях [5-10]. RAPD-маркеры, несмотря на присущие им недостатки, остаются одними из наиболее часто и успешно используемых для исследования изменчивости геномной ДНК ирисов [11-13].
Целью настоящей работы был поиск ДНК-маркеров, позволяющих оценить видовую самостоятельность I. vorobievii, I. mandshurica и I. humilis. Проанализировав имеющуюся литературу, для достижения поставленной цели мы выбрали RAPD-анализ и пять регионов хпДНК - межгенные спейсеры trnH-psbA и atpB-rpcL, ген rps4, не-кодирующие регионы trnL-trnF и trnS-trnG.
1575
RAPD-анализ и сравнение нуклеотидных последовательностей хпДНК этих таксонов, проведенные нами впервые, убедительно показали самостоятельность видов I. vorobievii, I. mandshurica и I. humilis и позволили сделать вывод об отсутствии I. humilis во флоре Приморского края и наличии видов I. vorobievii и I. mandshurica.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили растения из коллекционного питомника Ботанического сада-института ДВО РАН, которые были собраны в местах естественного произрастания видов: I. vorobievii N.S. Pavlova (17 образцов), Приморский край, Хасанский р-н, окр. пос. Крас-кино, редколесье дуба зубчатого с подлеском из леспедецы двуцветной, 31.05.2006, Р.В. Дудкин; I. mandshurica Maxim. (16 образцов), Приморский край, Шкотовский р-н, окр. г. Находка, сухие каменистые склоны сопок, 31.05.2006, Р.В. Дудкин; I. humilis Georgi (13 образцов), Западный Алтай, устье р. Чуя, прибрежные луга, 27.06.2006, Л.М. Пшенникова.
Индивидуальные препараты тотальной ДНК выделены по методике [14] из 50-100 мг листовой ткани.
Для RAPD-анализа выбраны девять праймеров произвольной последовательности - 0РА-01, ОРА-12, ОРВ-12, ОРВ-17, ОРВ-18, OPD-11, OPD-13, 0PD-08, 0PF-01 ("Орегоп", США), которые инициировали синтез наибольшего числа четких полиморфных фрагментов, воспроизводящихся в повторных экспериментах. Реакционная смесь и температурный режим ПЦР описаны нами ранее [15]. Для обозначения RAPD-локуса использовали название праймера, в присутствии которого он получен, и размер фрагмента в парах нуклеоти-дов. Для количественной оценки RAPD-полимор-физма (Р), генного разнообразия (H) и индекса Шеннона (SI) использовали пакет прикладных программ POPGENE [16]. Распределение генетической изменчивости по иерархическим уровням определяли с помощью анализа молекулярной вариации (AMOVA) в программе Arlequin ver. 3.1 [17]. Кластерный анализ проводили методом UPGMA, оценивая достоверность ветвления методом бутстрепа (1000 реплик), с помощью пакета прикладных программ TREECON [18]. В качестве внешней группы использованы растения вида I. bloudowii Ledeb. из коллекции живых растений Ботанического сада-института ДВО РАН.
Амплификацию trnH-psbA, atpB-rpcL, rps4, trnL-trnF и trnS-trnG регионов хпДНК проводили с использованием универсальных праймеров, реакционных условий и температурных режимов, рекомендованных для этих участков [19-22]. Концентрацию и размер продуктов оценивали с помощью электрофореза в агарозных гелях.
Циклическое секвенирование проводили в двух направлениях с праймерами, применявшимися для амплификации и дополнительными внутренними (табл. 1), и набором BigDye Terminator v.3.1 ("Applied Biosystems", США). ПЦР проводили в следующем режиме: 96°С - 10 с, 50°С - 5с, 60°С -2 мин 50 с (25 циклов). ^клеотидные последовательности определяли на генетическом анализаторе ДЖ ABI PRISM 310 ("Applied Biosystems", США) на базе БПИ ABO РАК С использованием вышеперечисленных методологических подходов у 46 растений определены нуклеотидные последовательности пяти регионов xпДHK, которые были депонированы в базу данных EMBL /GenBank/DDBJ (табл. 1).
Подготовку последовательностей к последующему анализу, включая их выравнивание, осуществляли с использованием программ Staden [23] и SEA VIEW [24]. Для каждого образца последовательности всех регионов объединяли. AMOVA и расчет таких популяционных параметров, как гап-лотипическое (h) и нуклеотидное (п) разнообразие, условный размер предковой гаплоидной популяции (б0), условный размер современной гаплоидной популяции (б1) и возраст современной популяции (т), были выполнены в программе Arlequin ver. 3.01 [17]. Тесты на популяционную стабильность - Tajima (D) [25], Fu (Fs) [26], Ramos-Onsins and Rozas (R2) [27], и анализ распределения парных различий [28] проведены с помощью программы DnaSP ver. 4.10.9 [29]. Значения дивергенции между нуклеотидными последовательностями (р-дистанции) получены с помощью пакета программ MEGA3 [30]. Bизyaлизa-цию возможных вариантов мутационных переходов между xпДHK-гaплoтипaми осуществляли с помощью программы TCS ver. 1.21 [31].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменчивость ядерного генома
Bыбрaнныe для RAPD-анализа праймеры успешно использовались нами ранее для изучения взаимоотношений дальневосточных видов рода Iris [11]. B настоящей работе при амплификации ДЖ 46 растений из трех популяций I. vorobievii, I. mandshurica и I. humilis получено 243 RAPD-фрагмента, из них 206 (84.8%) были полиморфными. Bыпoлнeнный по всем локусам тест Фишера на дифференциацию показал, что популяции достоверно отличаются друг от друга: %2 = = 813.8427, d. f. = 486, р = 0.0000. ^ждое растение обладало уникальным RAPD-фенотипом. Oбнa-ружены дифференцирующие маркеры, присутствующие только в одной популяции и отсутствующие в других. Популяция I. vorobievii маркируется четырьмя локусами (OPB-12-2159, OFD-ÛS-ll65 и OFD-ÛS-73Û, OFD-11-S36), I. mandshurica -одним (OPB-17-292), I humilis - двумя (OPA-Û1-132б и OFD-ÛS-1Û3Û). B табл. 2 представлены зна-
Таблица 1. Праймеры, используемые для ПЦР и секвенирования пяти регионов хпДНК ирисов, и номера доступа в EMBL/GenBank/DDBJ
Регион xпДHK Нуклеотидная последовательность (5' —► 3') Hoмep доступа в EMBL/GenBank/DDBJ
trnH-psbA 1CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (a, б) 1GTTATGCATGAACGTAATGCTC (a, б) FM253702-FM253747
atpB-rpcL 2AGAACCAGAAGTAGTAGGAT (a, 6) 2ACACCAGCTTTGAATCCAAC (а, 6) 2CATGGATGAATTCTGCCTA (6) FM863831-FM863876
rps4 3TACCGAGGGTTCGAATC (a, 6) 3ATGTCCCGTTATCGAGGACCT (а, 6) 3TTTTACTACAACTACTTGAGA (6) FM253385-FM253430
trnL-trnF 4CGAAATCGGTAGACGCTACG (a, 6) 4ATTTGAACTGGTGACACGAG (a, 6) 4GGGGATAGAGGGACTTGAAC (6) 4GGTTCAAGTCCCTCTATCCC (6)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.