БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 10, с. 1407 - 1415
УДК 577.152.1
САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА В ЛЮЦИФЕРАЗЕ СВЕТЛЯКОВ Lucióla mingrelica
© 2011 г. Ю.А. Модестова, Г.Ю. Ломакина, Н.Н. Угарова*
Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-2660, электронная почта: nugarova@gmail.com
Поступила в редакцию 07.02.11 После доработки 04.04.11
Методом сайт-направленного мутагенеза на основе плазмиды pETL7, кодирующей люциферазу светляков Lucióla mingrelica со вставкой His6 на С-конце, получены мутантные формы люциферазы, несущие единичные (C62S, C62V, C86S, C146S, C164S), двойные (C62/146S, C62/164S, C86/146S и C146/164S), а также тройную замену C62/146/164S. Мутации не повлияли на спектры биолюминесценции и флуоресценции фермента. Для мутантов C86S, C86/146S, C62/164S и C62/146/164S величины K mTP и KjjH увеличились в 1,5-1,9 раза, заметно снизились уровень экспрессии, удельная активность и термостабильность фермента. Для остальных мутантов величины KmTP и K mH2, удельная активность и уровень экспрессии не изменились. Термостабильность мутанта C146S увеличилась в ~2 и 1,3 раза при 37 и 42° соответственно. Обсуждается возможный механизм влияния данных мутаций на структуру и свойства фермента.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: люцифераза светляков, Lucióla mingrelica, сайт-направленный мутагенез, остатки цистеина, полигистидиновая последовательность, кинетические параметры, термостабильность.
Люцифераза светляков (КФ 1.13.12.7) катализирует окисление люциферина светляков кислородом воздуха в присутствии Mg2+ и ATP [1]. Высокая специфичность люцифераз и высокий квантовый выход биолюминесценции обуславливают широкое биоаналитическое применение данного фермента [2] и постоянный научный интерес к изучению структуры и функций люцифераз светляков [3]. В настоящее время известны первичные структуры более 20 люцифераз из светляков различных родов и видов. В состав молекулы люциферазы входят свободные остатки цистеина, причем их количество для люцифераз из разных источников варьирует в довольно широких пределах (от 4 до 14 остатков). Показано [4, 5], что хотя остатки цистеина не входят в состав активного центра, однако их мутагенез влияет на активность и стабильность люцифераз. Роль остатков цистеина в функционировании люцифераз до сих пор остается неясной. Наиболее известная люцифераза из амери-
Принятые сокращения: ""Г — исходная рекомби-нантная люцифераза; ДТТ — дитиотреитол; ПЦР — поли-меразная цепная реакция; Хвозб — длина волны возбуждения флуоресценции; ЯЬИ — относительные световые единицы; ЬН2 — люциферин светляков, £ин — константа скорости инактивации.
* Адресат для корреспонденции.
канских светляков Photinus pyralis содержит четыре остатка цистеина, из которых остатки 81, 258 и 391 консервативны почти для всех люцифераз. Единичные замены остатков цистеина на серин методом сайт-направленного мутагенеза привели к уменьшению активности фермента в 1,2—1,5 раза. Множественные замены остатков цистеина в люциферазе P. pyralis вызвали гораздо большее уменьшение активности. Например, мутант с четырьмя заменами C81/216/258/391S сохранил всего 6,5% активности. Причем явно прослеживалось взаимовлияние мутаций на активность фермента [4].
Люцифераза светляков Lucióla mingrelica содержит восемь остатков цистеина, три из которых соответствуют консервативным остаткам цистеина в люциферазе P. pyralis: 82, 260 и 393. Ранее были получены мутантные люциферазы L. mingrelica с единичными заменами этих остатков на аланин [5]. Введенные замены не влияли на спектры биолюминесценции и флуоресценции фермента, хотя и привели к некоторому ухудшению констант связывания люциферазы с люциферином и АТР. При этом стабильность мутанта C393A при температурах 5—35° увеличилась вдвое по сравнению с WT, а термостабильность мутантов с заменами C82A и C393A не изменилась. Плазмида pLR, кодирующая люци-
феразу, идентичную по структуре нативной лю-циферазе L. mingrelica, была использована нами ранее для получения мутантных форм фермента с единичными заменами неконсервативных остатков цистеина C62S, C146S [6] и C164S [7]. Эти замены также не оказали существенного влияния на каталитические и спектральные свойства люциферазы, однако привели к увеличению термостабильности фермента и уменьшению зависимости констант инактивации лю-циферазы от концентрации фермента (в отличие от WT). Кроме того, уменьшилось влияние ДТТ на стабильность люциферазы. Данные эффекты были наиболее выражены для фермента с заменой C146S. В связи с тем, что очистка ре-комбинатной люциферазы, полученной на основе плазмиды pLR, является сложным и многостадийным процессом, в данной работе мы использовали рекомбинантную люциферазу L. mingrelica, которая содержит вставку His6 на С-конце и экспрессируется в клетках Escherichia coli, трансформированных плазмидой pETL7 [8]. Это позволило существенно упростить схему очистки фермента, а также увеличить выход люциферазы за счет перехода к использованию высокоэффективной системы экспрессии штамма pET. Вопрос о влиянии полигистидиновой последовательности на свойства люциферазы светляков ранее в литературе не рассматривался, однако существуют публикации, указывающие на то, что введение последовательности His6 может изменять свойства ферментов [9—13].
Целью данной работы является изучение роли неконсервативных остатков цистеина в молекуле
люциферазы Ь. т1щге11еа, выявление взаимовлияния данных остатков и эффекта вставки Н^6 на активность и термостабильность фермента.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали рестриктазы BamHI, Bpu14I и TaqSE ДНК-полимеразу («СибЭнзим», Россия), олигонуклеотиды («Синтол», Россия), динатриевую соль ATP, БСА («Sigma», США), D-люциферин («Люмтек», Россия). Другие использованные препараты имели степень чистоты ос.ч. или х.ч. Растворы готовили на воде, полученной на установке Milli-Q («Millipore», Франция).
Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730-Avant.
Сайт-направленный мутагенез проводили на участке между сайтами рестрикции ^heI-BamHI (680 п.н.) гена люциферазы L. mingrelica. В качестве прямого и обратного праймеров использовали 5'-ATTATAGGAGGCTAGCAAAATGG-3' и 5'-GTAAATTGGATCCTTAGCGTG-3' соответственно, а также частично перекрывающиеся праймеры, содержащие вводимую в ген замену (табл. 1). Для получения единичных мутантов в качестве матрицы использовали плазмиду pETL7 [8], для получения мутантов с множественными заменами — соответствующие мутант-ные плазмиды, полученные на ее основе. На
Таблица 1. Состав праймеров для введения точечных мутаций
Замена Праймер t° *
C62S прямой: 5'-GATATTACATCTCGTTTAGCTGAGGCCATG-3' обратный: 5'-GCTAAACGAGATGTAATATCAAAGTATTC -3' 60 54
C62V прямой: 5'-GATATTACAGTTCGTTTAGCTGAGGCCATG -3' обратный: 5'-CTTATGAAACTATAATGTCAAGCAAATCG -3' 60 54
C86S прямой: 5'-AAATTCTTCAGAATTTTCACTGCACAAAGC-3' обратный: 5'-GCAGTGAAAATGAAGAATTTTTCATCCCTG-3' 54 52
C146S прямой: 5'-AAACAGTTACATCCATCAAAAAAATTGTTATTTTAG-3' обратный: 5'-TTTTTTTGATGGATGTAACTGTTTTTTGCACTTC-3' 56 56
C164S прямой: 5'-CCACGATTCTATGGAAACTTTTATTAAG-3' обратный: 5'-GTTTCCATAGAATCGTGGCCCCCAAAG-3' 54 61
* Температура амплификации.
первой стадии синтезировали два фрагмента ДНК, кодирующие вводимую мутацию, и имеющие частично перекрывающиеся концы. Реакционная смесь (50 мкл) для получения 5'-конце-вого фрагмента ДНК содержала 60 мМ Tris-HCl, pH 8,5, 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-мер-каптоэтанол, 0,1%-ный Triton X-100, 20 пмоль прямого праймера, 20 пмоль обратного прайме-ра, несущего вводимую замену, 50 нг плазмиды, 100 мкг БСА, 50 мкМ dNTP, 2,5 ед. ДНК-поли-меразы TaqSE. Реакционная смесь (50 мкл) для получения З'-концевого фрагмента имела тот же состав, но содержала 20 пмоль обратного прай-мера и 20 пмоль прямого праймера, несущего соответствующую замену. ПЦР проводили на амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) при следующих условиях: 95°, 1 мин; затем 25 циклов по следующей программе: 1 мин — 94°, 1 мин — Ta (табл. 1), 2 мин — 72°; затем достройка в течение 10 мин при 72°. Продукты ПЦР очищали с помощью электрофореза в 1%-ной агарозе с последующим выделением из геля с использованием набора фирмы «Qiagen». Полученные фрагменты сшивали методом ПЦР в условиях, описанных выше (Та = 53°). Реакционная смесь (50 мкл) имела тот же состав, что указан выше, но вместо 50 нг плазмиды содержала по 5 нг каждого из полученных на предыдущей стадии фрагментов. Продукт реакции очищали и выделяли как описано выше, обрабатывали рестриктазами BamHI и Bpu14I (сайт рестрикции Bpu14I в синтезированном фрагменте находится на расстоянии 138 п.н. от сайта рестрикции NheI), очищали от низкомолекулярных продуктов рестрикции с помощью электрофореза, выделяли из геля и лигировали в расщепленную по этим же сайтам плазмиду pETL7, получая плазмиду, содержавшую мутантный ген люциферазы. Штамм E. coli XL1Blue трансформировали полученной плазмидой, клетки рассеивали на чашки Петри со средой LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина. Наличие замен в нуклеотидной последовательности плазмиды подтверждали секвенированием.
Получение и очистка люциферазы. Клетки E. coli BL21(DE3) CodonPlus («Stratagene», США) трансформировали соответствующими мутант-ными плазмидами. Наработку люциферазы осуществляли по методу автоиндукции лактозой [14]. На чашку со средой LB, содержавшей 100 мкг/мл ампициллина и 1,5%-ный бактоагар, высевали клетки E. coli BL21(DE3)CodonPlus, содержавшие плазмиду pETL7 с геном исходной или мутантной люциферазы, и инкубировали в течение ночи при 37°. Несколько колоний инокулировали в бакпечатку с 3 мл среды LB с 200 мкг/мл ампициллина и 1%-ной глюкозой,
растили 5—6 ч на качалке при 37°, 180 об/мин, пока суспензия клеток не становилась мутной (А600 = 0,4—1,0). Разбавляли культуру до А600 ~0,0024, внося рассчитанный объем клеточной культуры в колбу с 200 мл среды ZYP-5052 [14], содержавшей 100 мкг/мл ампициллина, инкубировали на качалке ~2 ч при 37°, 180 об/мин, пока суспензия не ста
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.