ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ БИОЛОГИИ, 2012, том 73, № 2, с. 83-87
УДК 577
ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ В ЭМБРИОНЕ АКТИНИИ NEMATOSTELLA VECTENSIS
© 2012 г. Л. Б. Попова2, Д. А. Ворнов12, И. А. Косевич3, Ю. В. Панчин12
1Институт проблем передачи информации РАН 127994 Москва, Большой Каретный переулок, 19 2ИФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ 119991 Москва, Ленинские горы 3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет 119991 Москва, Ленинские горы
e-mail: lala_popova@mail.ru Поступила в редакцию 20.08.2011 г.
У многоклеточных животных (Metazoa) межклеточные каналы, соединяющие цитоплазму соседних клеток, построены из белковых молекул и называются щелевыми контактами. Они найдены в разных группах животных и считаются универсальным признаком Metazoa. До недавнего времени кишечнополостные класса Anthozoa (кораллы и актинии) считались исключением из этого правила. Структурные и физиологические данные не подтверждали наличия щелевых контактов у этой группы. В геноме актинии Nematostella vectensis (Cnidaria, Anthozoa) и других Anthozoa не удавалось найти генов, гомологичных двум известным на настоящий момент семействам белков щелевых контактов - коннексинам и паннексинам. В недавних исследованиях был обнаружен гомолог паннексина нематостеллы, а наши исследования показали наличие щелевых контактов между бластомерами эмбриона этого животного. Электрическая связь между бластомерами эмбриона Nematostella на стадии 8 клеток обнаружена в физиологических экспериментах. При этом флуоресцентная краска (карбоксифлуоресцеин) не перетекает из окрашенного бластомера в соседние клетки. Это доказывает, что имеющаяся электрическая связь не обусловлена цитоплазмати-ческими мостиками, оставшимися в результате неполного дробления. Эти данные подтверждают представление о всеобщности щелевых контактов у Metazoa и универсальности белков щелевых контактов паннексинов.
Обнаружение электрической связи между контактирующими клетками животных послужило основой для открытия щелевых контактов (ЩК). Два разных экспериментальных подхода сыграли важнейшую роль в дальнейших исследованиях межклеточных каналов: электрофизиологические измерения межклеточной связи и эксперименты с инъекцией краски, показавшие, что небольшие молекулы флуоресцентных красок, проинъециро-ванные в одну клетку, могут проходить в соседние клетки (Furshpan, Potter, 1959; Loewenstein, 1981; Chailakhyan, 1990; Dermietzel et al., 1990; Levin, 2002). Используя эти два подхода, были получены многочисленные экспериментальные данные о ЩК на многих экспериментальных животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, включающие исследования на многих типах клеток и тканей (Dermietzel et al., 1990). Из проведенных работ следовало, что ЩК позвоночных
и беспозвоночных животных имеют сходный размер поры, сходные электрические характеристики и чувствительность к фармакологическим агентам. Физиологические данные подтверждены электронно-микроскопическими исследованиями, и структуры, ассоциированные с ЩК, были обнаружены в тканях различных животных, как позвоночных, так и беспозвоночных (Bruzzone et al., 1996; Phelan, Starich, 2001; Levin, 2002).
Коннексины были идентифицированы как молекулярные компоненты ЩК позвоночных более 20 лет назад. Первая последовательность кДНК коннексина была клонирована и секвенирована в 1986 г. (Paul, 1986). Вскоре были найдены еще несколько сходных молекул этого мультигенного семейства (Willecke et al., 2002). После открытия коннексинов (Goodenough, 1974; Paul, 1986) многочисленные попытки найти сходные молекулы у беспозвоночных провалились, и в итоге было
84
ПОПОВА и др.
предложено, что ЩК беспозвоночных состоят из белков, не родственных коннексинам. Это семейство белков исходно назвали OPUS (Barnes, 1994). Предполагалось, что это семейство специфично для беспозвоночных, поэтому его переименовали в иннексины (innexins - invertebrate analog of connexins) (Phelan, Starich, 2001). Когда мы нашли гомологи иннексинов у позвоночных, было предложено объединить иннексины беспозвоночных с их гомологами из позвоночных в единое семейство паннексинов (Panchin et al., 2000; Baranova et al., 2004; Panchin, 2005). Мы предположили, что паннексины являются универсальными белками ЩК многоклеточных животных в отличие от кон-нексинов, характерных только для хордовых.
ЩК представляются универсальным признаком Metazoa. До недавнего времени Anthozoa считались исключением из этого правила. Структурные и физиологические данные не подтверждали наличия ЩК у этой группы. Прямых данных, демонстрирующих электрические связи между клетками Anthozoa, получено не было, морфологических структур, сходных со структурами ЩК других животных, не наблюдалось, а особенности электрофизиологических характеристик тканей животных этой группы могли объясняться отсутствием ЩК между клетками (Mackie et al., 1984; Magie, Martindale, 2008; Satterlie, 2011). Гены, кодирующие белки, гомологичные известным белкам ЩК (коннексинам и паннексинам), также долгое время не удавалось обнаружить, хотя полный геном одного из представителей Anthozoa (Nematostella vectensis) был прочитан с высоким уровнем покрытия (Putnam et al., 2007). В связи с этим в литературе обсуждался вопрос о том, есть ли вообще у Anthozoa ЩК и соответствующие белки ( Litvin et al., 2006; Putnam et al., 2007; Panchin, 2007; Magie, Martindale, 2008; Shestopalov, Panchin, 2008; Satterlie, 2011). В недавних исследованиях у нематостеллы был обнаружен гомолог паннексина (Chapman et al., 2010). Наши исследования, представленные ниже, показывают наличие функциональных ЩК между бластомерами эмбриона этого животного.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Актиний Nematostella vectensis культивировали в морской воде (12%о) при температуре 18 °C и кормили 5 раз в неделю науплиями Artemia salina. Гаметогенез индуцировали световым режимом и сдвигом температуры, как описано ранее (Fritzenwanker, Technau, 2002). Кладки яиц оплодотворяли in vitro.
Электрофизиологические исследования развивающихся эмбрионов выполняли в морской воде (12% ) при 18 °C. Эмбрионы помещали в чашку Петри с 300-мкм пластмассовыми лунками на дне. Чашку Петри помещали в металлическую камеру, изолирующую от внешних электромагнитных полей. Для записи использовали усилители Axoclamp 2B (Axon Instruments) со стеклянными микроэлектродами, заполненными 2М KCl, сопротивление которых составляло 10-20 MQ. Записи сохраняли и анализировали в компьютере с помощью аналого-цифрового преобразователя DigiData 1200 series ADC и программы pCLAMP (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Для статистического анализа результатов использовали программу SigmaPlot 9.0 (Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA). Для инъекции красителя один из электродов заполняли 3%-ным карбоксифлуорес-цеином на 0.2М растворе KCl. Инъекцию краски в единичные бластомеры на стадии восьми клеток проводили отрицательным током силой 10 нА в течение 1 мин. Эмбрионы с проинъецированными краской бластомерами изучали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX51, оснащенного цифровой камерой Olympus XC10 и набором фильтров, оптимизированных для флуоресцеина.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Известно, что бластомеры ранних стадий эмбрионов разных животных часто соединены посредством ЩК (Kumar, Gilula, 1996, Levin, 2007). Крупный размер клеток в ранних эмбрионах облегчает использование микроэлектродов.
Ранние бластомеры Nematostella vectensis не разделены, но слиты в единый синцитий до стадии четырёх клеток включительно. Начиная со стадии восьми клеток и далее, они полностью отделены друг от друга (Kraus, Technau, 2006). Поэтому в наших экспериментах мы использовали зародыши на стадии восьми клеток после полного завершения третьего деления дробления. Схема эксперимента изображена на рисунке, А: два электрода I-1 и V-1 находятся в одной клетке, в то время как третий электрод, V-2, погружен в другую клетку зародыша. Чтобы обнаружить электрическую связь между бластомерами, через электрод I-1 пропускали толчки отрицательного электрического тока. Сопутствующие этим толчкам тока изменения напряжения на мембране регистрировали через электроды V-1 и V-2. Отклонение мембранного потенциала второй клетки, измеренное через электрод V-2, указывало на её электрическую связь с первой клеткой. В качестве меры этой электрической связи использовали
ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ В ЭМБРИОНЕ АКТИНИИ NEMATOSTELLA VECTENSIS
85
отношение ДУ-2/ДУ-1, называемое «коэффициентом связи». Пример подобного эксперимента изображён на рисунке, Б. Отрицательный ток силой 10 нА был пропущен через электрод 1-1, находящийся в первой клетке, что привело к скачку потенциала в -17 мВ на мембране этой же клетки. Одновременно на мембране второй клетки скачок мембранного потенциала составил -13 мВ. Таким образом, коэффициент связи в данном случае составил 0.76.
Из-за быстрого темпа дробления бластомеров в одном восьмиклеточном зародыше успевали исследовать электрическую связь между одной парой бластомеров. Всего было исследовано 17 зародышей, причём все исследованные пары бла-стомеров были электрически связаны. Коэффициенты связи колебались от 0.46 до 0.97 со средним значением ДУ-2/ДУ-1 = 0.81 ± 0.03 (указано среднеквадратичное отклонение).
Во всех экспериментах бластомеры были элек-трофоретически проинъецированы флуоресцентной краской карбоксифлуоресцеином через электрод У-1. Ни в одном из опытов не был отмечен перенос краски из проинъецированной клетки в другие бластомеры зародыша в течение 1 ч после инъекции. На рисунке, В и Г показан вось-миклеточный зародыш с бластомером, проинъе-цированным карбоксифлуоресцеином. Картина флуоресценции на рисунке, Д чётко показывает присутствие карбоксифлуоресцеина только в про-инъецированной клетке, без каких-либо признаков его диффузии в соседние клетки. Даже позднее, после завершения очередного цикла дроблений, на стадии 16 клеток, карбоксифлуоресцеин остается только в двух потомках проинъецированной клетки (рисунок, Е).
ОБСУЖДЕНИЕ
С момента их открытия в ранние 1960-е годы ЩК рассматривали как главный и даже единственный тип межклеточных каналов и представляли универсальным
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.