БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 1 * 1993
УДК 547.466'571.057
© 1993 Ю. Н. Белоконь, К. А. Кочетков, Н. В. Филева, Н. С. Иконников, С А. Орлова, 3. Б. Бакасова
ОСНОВАНИЯ ШИФФА ЭФИРОВ «АМИНОКИСЛОТ — СУБСТРАТЫ ДЛЯ ЭНЗИМАТИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ¿-АМИНОКИСЛОТ
Институт элементоорганических соединений РАЛ, Москва
Эфиры !Ч-ациламинокислот относятся к наиболее распространенным субстратам ферментативного гидролиза а-химотрипсином с целью получения ¿-аминокислот [1 ], однако они требуют специальных методов получения. Несколько меньшая скорость гидролиза и почти такая же энантиоселективность наблюдалась при использовании в качестве субстратов эфиров свободных а-аминокислот [2 ]. К сожалению, эти соединения малоустойчивы, димеризуются в дикетопиперазины [3 ]; легкая конденсация эфиров используется и в пластеиновой реакции [4 ]. В то же время основания Шиффа эфиров аминокислот с бензальдегидом доступны и устойчивы в чистом виде в течение нескольких месяцев [5].
Ранее нами разработан новый метод химико-ферментативного получения оптически чистого фенилаланина и его фторированных аналогов, замещенных в ароматическом кольце из соответствующих оснований Шиффа [6 ]. Основания Шиффа эфира фенилаланина и его Ё-производных получали алкилированием галоидными алкилами продуктов взаимодействия эфира глицина с бензальдегидом и далее гидролизовали в водно-органических средах в присутствии а-химотрипсина до свободных ¿-аминокислот.
Продолжая исследование оснований Шиффа эфиров аминокислот, пригодных в качестве новых субстратов для ферментативного гидролиза, мы в данной работе сообщаем о распространении предложенного метода на основания Шиффа ряда других а-аминокислот следующей общей формулы: РЬСН = N - СН(ЮСООЕ1, где Я = Ме (I), м-Ви (II), -СН2-уЗ-индолил (III), Р1г (IV) и СН2-а-нафтил (V).
Эти соединения могут быть получены прямым путем в одну стадию из эфиров соответствующих а-аминокислот взаимодействием с бензальдегидом в присутствии водоотнимающих средств [5], в то время как взаимодействие основания Шиффа, образованного эфиром глицина и бензальдегидом, с соответствующими галоидными алкилами обычно сопровождается появлением продуктов бисалкилирования, затрудняющих разделение продуктов реакции [7].
а-Химотрипсин гидролизует метиловые эфиры альдиминов (I—V) в среде МеСМ/Н20 (17,5:1) при рН 7 с образованием ¿-аминокислот (таблица). Поскольку превращение соединений (I—V) в соответствующие аминокислоты не сопровождается изменением рН раствора, ферментативный гидролиз был успешно осуществлен и без добавления в раствор буферных компонентов, необходимых для поддержания рН 7 [8 ]. При этом растворимость субстратов в органических растворителях позволила провести ферментативный гидролиз в смешанной водно-органической среде. В этих условиях образующаяся ¿-аминокислота выпадает в осадок и после окончания ферментативного гидролиза фильтрованием отделяется
Энантиомерный анализ продуктов ферментативного гидролиза субстратов формулы t PhCH-NCH(R)COOEt-xMMorpHncHHOM в среде MeCN/НгО (17,5: 1 по объему) при 25° С
Номер Время ч L-AK о.ч. оставшейся в
соединения R Аминокислота Выход, % о.ч., % смеси АК (избыток О-энантиомера, %)
(0 СНз Ala 110 37 84 36
(II) СНз(СН2>2 Nya 210 33 93 40
(III) С112-/3-индолил Тгр 110 40 79 **
(IV) Ph (Ph)GIy 240 29 88 6
(V) СШ-о-нафтил (нафтил)А1а 75 8 99 *«
(VI) CH2Ph Phe [6] 24 38 99 95
(VII) 2-F-C6H4CH2 (2F)Phe [6] 20 21 98 50
(VIII) CH(OH)Ph (Ph)Ser 120 0 — 0***
Концентрация субстрата — 0,12 М, а-химотрипсина — 4,3 • Ю-1 М. <(<Не анализировали.
Ферментативный гидролиз не идет.
от раствора, содержащего непрореагировавший субстрат, обогащенный D-энан-тиомером, и бензальдегид. При этом благодаря низкой концентрации аминокислоты со свободной NH2-rpyrinoii в растворе уменьшается возможность образования побочных продуктов взаимодействия по карбонильной группе эфира, подобно тому как это наблюдалось в работе [9].
После осаждения фермента трихлоруксусной кислотой и химического гидролиза непрореагировавшего субстрата с 6н. HCl аминокислота, обогащенная £>-энанти-мером, также может быть выделена (таблица). Химические выходы аминокислот определяли методом ГЖХ с использованием внутреннего стандарта L-лейцина. Энантиомерный анализ аминокислот проводили методом ГЖХ с использованием неподвижной высокотемпературной хиральной полисилоксановой диамидной фазы типа Chirasil-Val [10].
Специальными опытами с использованием в качестве субстрата соединения (VI) была показана высокая стабильность а-химотрипсина в данной водно-органической среде. Активность а-химотрипсина за 96 ч снижалась лишь на 40%. Следует отметить, что ранее не был обнаружен гидролиз L-энантйомера (III) а-химотрипсином в фосфатном буфере при pH 8—10, а наблюдался лишь медленный гидролиз Д-энантиомера [8 ]. В наших нейтральных условиях реакции то же соединение (III) гидролизуется до L-триптофана (таблица), что мы связываем с его промежуточным неферментативным гидролизом до эфира аминокислоты со свободной NH2-rpynnoü и бензальдегида, который завершается ферментативным гидролизом эфира. Возможность же медленного ферментативного гидролиза ö-энантиомера (III), обнаруженная в работе [8], вероятно, несколько снижает наблюдаемую нами оптическую чистоту (о.ч.) выделяющейся из реакционной смеси ¿-аминокислоты. Наличие такого обратимого химического гидролиза для основания Шиффа (VI) в системе MeCN/H20 (17,5 : 1) нами было показано ранее. Факт снижения энантиоселективности и скорости ферментативного гидролиза при переходе от эфиров N-ацетиламинокислот к эфирам свободных аминокислот отмечен в работе [2], причем особенно существенным он был, как и в нашем случае, для неспецифических для а-химотрипсина аминокислот. Таким образом, совокупность имеющихся данных согласуется с предположением о предварительном неферментативном обратимом расцеплении альдиминной связи в условиях реакции, в результате чего энантиоселективному гидролизу по хорошо изученному механизму [2,9 ] подвергается уже эфир со свободной NHj-группой.
Как видно из данных таблицы, несмотря на длительное время гидролиза
новых неспецифических для а-химотрипсина субстратов, с удовлетворительными выходами может быть получен ряд ¿-аминокислот.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Верховская М. А., Ямское И. А.//Успехи химии. 1991. Т. 60. № 10. С. 2250—2280.
2. Ямское И. А., Тихонова Т. В., Даванков В. Д.//Биоорган. химия. 1979. Т. 5. № 1. С. 113—118.
3. Гринштейн Дж., Винищ М.//Химия аминокислот и пептидов: Пер. с англ. М.: Мир, 1965.
С. 291.
4. Беликов В. М., ГололоГюв М. ».//Успехи химии. 1979. Т. 48. № 9. С. 1684—1710.
5. GhosezL., AntoineJ. P., DeffenseE., NavarroM., Libert У., O'DonnellM. J., Bruder W. A.//Tetrahedron
Lett. 1982. V. 23. № 41. P. 4255—4258.
6. Белокоиь Ю. H., Кочетков К. А., Тараров В. И., Савельева Т. Ф., Филева Н. В., Гарбалинская
Н. С., Сапоровская М. Б., Бакасова 3. Б.//Биоорган, химия. 1991. Т. 17. № 6. С. 773—778.
7. O'Donnell М. ]., Bennet IV. V., Bruder W. A., Jacobsen W. N.. Knuth К., LeClef В., Polt R. L.,
Bordwell F. G., Mrozack S. R., Cripe T. A.I/J. Amer. Chem. Soc. 1988. V. 110. № 25. P. 8520—8525. 8- Швядас В. К., Галаев И. Ю., Иванов А. Е., Березин И. В.//Биоорган, химия. 1980. Т. 6. № 10. С. 1554—1558.
9. Barbas С. F., Matos J. R., West J. В., Wong С. Н.ЦJ. Amer. Chem. Soc. 1988. V. 110. № 15.
P. 5162—5166.
10. Сапоровская M. Б., Волкова JI. M., Павлов В, A.IIЖурн. аналит. химии. 1989. Т. 44. № 3. С. 525—528.
Поступило в редакцию 24. VI. 1992 После доработки 26.VIH.1992
Yu. N. BELOKON', К. A. KOCHETKOV, N. V. F1LEVA, N. S. IKONNIKOV, S. A. ORLOVA, Z. В. BACASOVA
SCHIFF BASES OF AMINO ACIDS ESTERS AS SUBSTRATES FOR ENZYMATIC RESOLUTION OF ¿-AMINO ACIDS
A. N. Nestneyanov Institute of Elementoorganic Compounds, Russian Academy of Sciences, Moscow
Schiff bases of the type: PhCH-NCH(R)COOEt, where R-Me, n-Bu, Ph, /З-indolyl, cr-naphtyl, were used as new substrates for enzymatic hydrolysis. These compounds, derived from ethyl esters of some D, L-amino acids and ben?aldehyde, after hydrolysis with «-chymotripsin in the aqueous-organic medium without any buffer components were shown to yield ¿-amino acids (Ala, Nva, (Ph)Gly, Trp and naphtylalanine) which precipitated from the solution. Their enantiomeric purities were in the range of 79—99%.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.