БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 454-461
УДК 577.3;577.175.822;581.13.135
СЕКРЕТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ СЕНПОЛИИ В ИССЛЕДОВАНИИ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ
© 2013 г. В. В. Рощина*, В. А. Яшин
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская область, Пущино, Институтская ул., 3;
*электронная почта: roshchinavic@mail.ru Поступила в редакцию 18.04.2013 г.
Клетки лепестков цветущей сенполии Saintpaulia ionantha Wendl. после обработки ацетилхолином или связывающимися с холинорецепторами агонистами никотином, мускарином, ареколином, хи-нуклидинилбензилатом выделяли антоцианы и белки (среди которых фермент холинэстераза) в наружную среду. Секреция в значительной мере блокировалась d-тубокурарином, тетраэтиламмони-ем, атропином и платифиллином, что указывает на участие в секреторном процессе холинорецеп-торов смешанного типа (как никотинового, так и мускаринового). Поскольку агенты форсколин и теофиллин (соответственно стимулятор аденилатциклазы и ингибитор фосфодиэстеразы), повышающие уровень циклического AMP в клетке, стимулировали выход секреторных продуктов, предполагается внутриклеточная сигнализация с помощью cAMP как вторичного мессенджера — от плазмалеммы к тонопласту вакуоли, содержащей антоцианы. Чувствительность секреции клеток лепестков к ацетилхолину и другим агентам, связывающимся с холинорецепторами животных, позволяет использовать этот объект как модель для исследования холинергической системы растений.
Ключевые слова: агонисты и антагонисты, антоцианы, Saintpaulia ionantha, никотин, ареколин, хи-нуклидинилбензилат, d-тубокурарин, тетраэтиламмоний, атропин, платифиллин, секреция, хо-линэстераза, форсколин и теофиллин,
Б01: 10.7868/80233475513050150
Моделирование процессов с участием клеток-доноров секрета и клеток-акцепторов, биосенсоров, воспринимающих и реагирующих на компоненты этого секрета в виде какого-либо физиологического ответа, является одним из экспериментальных подходов к изучению механизмов межклеточной химической сигнализации в коммуникации организмов [1]. Поиск удобных моделей-акцепторов (биосенсоров) секретов входит в задачу исследователей рецепции компонентов секрета и механизмов внутриклеточной сигнализации с их участием. В качестве клеточных моделей могут быть системы, чувствительные к биологически активным соединениям, таким, как аце-тилхолин и биогенные амины, найденные в секретах у всех живых организмов [2]. Ранее для этой цели были предложены растительные микроспоры (микроспоры хвоща Equisetum агувтв и пыльца Hippeastrum НуЬШит), у которых физиологическими ответами на нейротрансмиттеры служили изменения собственной флуоресценции клеток и ростовые реакции [3].
О передаче хемосигнала с поверхности внутрь клетки судят по возникновению или блокаде потенциала действия, накоплению вторичных мес-сенджеров (циклических нуклеотидов, инозитол-
трисфосфата, ионов кальция и др.) и активации ферментов синтеза и катаболизма вторичных посредников. Основная масса исследований такого рода для нейротрансмиттеров как хемосигналов проведена на клетках животных. Аналогичные подходы были применены и к пыльце растений в качестве модели [4]. Рассматривались и вопросы внутриклеточной сигнализации: связь между прорастанием пыльцы, инициируемым ацетилхолином, гистамином и серотонином, и активностью ферментов аденилатциклазы и фосфодиэстеразы, регулирующих образование вторичного мессенджера циклической AMP [4]. Передачу сигнала к органеллам от плазмалеммы ранее анализировали по реакции деления ядер и хлоропла-стов как физиологического ответа интактных клеток на добавление в среду соединений, являющихся нейротрансмиттерами животных [5]. Вакуоли, содержащие пигменты, с этой целью еще не анализировали. Требовалось найти для подобных исследований подходящую модельную систему. Поиск удобных объектов был проведен среди сек-ретирующих пигментированных клеток разных видов растений, и в секретах некоторых из них, в частности лепестков сенполии, обнаружена хо-линэстеразная активность [6], что обычно являет-
ся маркером на чувствительность клеток к аце-тилхолину. Представлялось перспективным использовать секрецию пигментов (антоцианов), содержащихся в вакуоли, для ингибиторного (фармакологического) анализа рецепции ацетил-холина и возможного механизма внутриклеточной сигнализации.
Данная работа посвящена анализу действия ацетилхолина, агонистов и антагонистов, обычно связывающихся с холинорецепторами, на секрецию пигмента антоциана из лепестков сенполии как физиологического ответа данной модели.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили лепестки цветков растений узамбарской фиалки сенполии Saintpaulia ionantha Wendl., выращенных в теплице. Секрецию антоциана оценивали по спектрам поглощения и флуоресценции, как живых клеток, так и 1-часовых водных экстрактов из них. (Изотоническая среда содержала, мкг/л: KH2PO4 6.63; СаС12 6.51; NaCl 3.47; MgCl2 5.)
Поглощение и собственную флуоресценцию живых клеток измеряли непосредственно на предметных стеклах с помощью спектрофотометров Specord M-40 (Германия), Unicam Helios-epsilon (США), Evolution 600 — Thermo Sci. Intertech. Corp. (США), спектрофлуориметра Perkin Elmer 350 MPF-44B (Великобритания) и лазер-скани-рующего конфокального микроскопа Leica TCS SP-5 (Германия—Австрия—США). Фотографировали образцы с помощью люминесцентного микроскопа Leica DM6000 B и вышеупомянутого конфокального микроскопа. Спектры поглощения и флуоресценции растворов с вышедшим наружу секретом в 0.5-, 1-, 5-см кюветах регистрировали с помощью указанных выше спектрофотометров и спектрофлуориметра. Антоцианы экстрагировали в течение 1 ч раствором вода—этанол (1 : 1) из гомогенизированной навески (10 г) лепестков, фильтровали гомогенат, очищали на тонкослойных пластинках силикагеля, затем регистрировали их спектры поглощения и флуоресценции для сравнения с данными, полученными на интактных клетках. Среднюю ошибку опыта из трех-четырех повторностей вычисляли соответственно для каждого варианта и контроля. Концентрацию антоцианов (K), вышедших в раствор, рассчитывали по формуле:
K = Л530/EMV,
где A630 — оптическая плотность при 630 нм; Е — коэффициент молярной экстинкции цианидин-3-О-гликозида при 630 нм = 3 х 104 М-1 см-1; M— молекулярная масса цианидин-3-О-гликозида = = 449.2; V — объем экстракта, мл. В секретах определяли содержание белка по методу Брэдфорда [7] и холинэстеразную активность по модифицированному методу Эллмана [8].
В работе использовали реагенты фирмы "Sigma" (США): ацетилхолин, агонисты никотин, ареколин, хинуклидинилбензилат, мускарин, стимулятор аденилатциклазы форсколин, ингибитор фосфодиэстеразы теофиллин, связывающиеся с холинорецепторами агенты d-тубокура-рин (блокатор натриевых и калиевых ионных каналов и никотинового типа холинорецептора), тетраэтиламмоний (блокатор калиевых ионных каналов в холинорецепторе никотинового типа), атропин (связывается с мускариновым типом хо-линорецептора), ингибитор эндоплазматического везикулярного транспорта в секреции белков бре-фельдин А, а также реактив фирмы "Новосибхим-фарм" (Россия) платифиллин, который связывается с мускариновым типом холинорецептора.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор объекта исследования обусловлен присутствием в синих лепестках сенполии антоциа-нов, цвет которых и автофлуоресценция в ультрафиолетовом свете позволяет легко их обнаружить в клетках. Окраска цветков обусловлена ацетили-рованными антоцианами. Установлено присутствие в основном 3-0-[6-0-(4-0-(аее1у1)-а-рамно-пиранозил)-р-глюкопиранозид]-5-0-ф-глюкопи-ранозид)-мальвидина, пеонидина и пеларгонидина [9]. Предполагалось рассмотреть изменения поглощения и собственной флуоресценции, как лепестков, так и их секретов, вышедших в раствор за сравнительно короткое время. Вышедший в изотоническую среду секрет обнаруживали по присутствию пигмента в экстракте. Регистрировали спектральные характеристики экстрактов и интактных лепестков.
Микроскопический анализ и спектральные характеристики интактных клеток. На рис. 1A видны клетки эпидермальной поверхности синего лепестка, включающие антоцианы вакуоли с антоцианосомами (тельцами, концентрирующими эти пигменты и окруженными мембраной [10—12], показано стрелками). В спектре поглощения интактного лепестка сенполии (рис. 1Б) отчетливо видны максимумы 530, 574 и 630 нм, принадлежашие антоцианам. Синий цвет лепестков обусловлен окраской антоцианов в щелочной среде, характерной для вакуолей этого вида растения, в связи с этим отмечаются значительные по высоте максимумы 574 и 630 нм. Спектры поглощения изолированных пигментов (очищенных с помощью тонкослойной хроматографии антоци-анов) имели преимущественно один максимум поглощения при 630 нм, а после подкисления среды появлялся пик при 530 нм (что характерно для красной окраски антоцианов в кислой среде). При возбуждении светом 360 нм у интактного лепестка регистрировали флуоресценцию (рис. 1В) с максимумами 413 (наибольший) и 675—687 нм. Синюю окраску имели не только собственно ле-
Б
Интактный лепесток
В
0
400 500 600 700 Длина волны, нм
■ 400
| 300 и
я 200
е я
^^ 100
о ^
л
О п
400 500 600 Длина волны, нм
700
В
от200
«
и я н е я
с е
Л
о
л
О
100 -
400
500
600
700
Длина волны, нм
0
ф
IV
Рис. 1. Вид и спектральные характеристики лепестка сенполии. А — вид в обычном микроскопе клеток поверхности лепестка, где вакуоли с антоцианосомами внутри (показано стрелками) занимают основной клеточный объем. Б и В — спектры поглощения и флуоресценции поверхности лепестка и изолированных антоцианов (сплошная линия для антоцианов — при исходном рН 7.6 после экстрации, прерывистая линия — спектр поглощения после добавления 9% уксусной кислоты до рН 5.0, флуоресценция в этом случае практически отсутствовала). Г и Д — снимки интактного секреторного волоска, сделанные соответственно камерами обычного и лазер-сканирующего микроскопов, с помощью последнего получены и спектры флуоресценции отдельных участков волоска (Е). а — головка волоска, б — ножка волоска, в — пигментированный участок в основании волоска. Лазер 405 нм. Мас
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.