НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 2, с. 116-122
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.175.829
СЕКРЕЦИЯ НОРАДРЕНАЛИНА ИЗ МОЗГА В ОБЩУЮ СИСТЕМУ ЦИРКУЛЯЦИИ В ОНТОГЕНЕЗЕ У КРЫС
© 2015 г. Ю. О. Зубова*, Н. С. Бондаренко, А. Я. Сапронова, М. В. Угрюмов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Проведено исследование эндокринной функции норадренергической системы развивающегося мозга. Данные по возрастной динамике концентрации норадреналина в плазме крови и в важнейших но-радренергических центрах мозга — гипоталамусе и мезэнцефалоне-ромбэнцефалоне — до и после формирования гематоэнцефалического барьера косвенно свидетельствуют о возможности поступления норадреналина из мозга в общую систему циркуляции. На модели хронического специфического ингибирования синтеза норадреналина в мозге неонатальных крыс впервые получены прямые доказательства того, что у крыс мозг в онтогенезе до формирования гематоэнцефалического барьера является источником норадреналина в общей системе циркуляции, что позволяет предположить его участие в регуляции развития и функционирования периферических органов — мишеней.
Ключевые слова: норадреналин, гематоэнцефалический барьер, онтогенез, гипоталамус, мезэнцефалон-ромбэнцефалон, общая система циркуляции, нейротоксин, крыса.
Б01: 10.7868/81027813315020132
Нейроэндокринная система играет ключевую роль в поддержании целостности и гомеостаза организма, а также в регуляции практически всех его функций. Развитие нейроэндокринной системы в онтогенезе представляет особый интерес, поскольку химические сигналы, вырабатываемые ее элементами, управляют развитием всего организма в целом. Малейшие нарушения этой регуляции приводят к развитию практически некор-регируемых в течение всей жизни врожденных заболеваний [1, 2].
До недавнего времени считалось, что развитие нейроэндокринной системы начинается довольно рано в онтогенезе с образования периферических эндокринных желез, однако они функционируют автономно до тех пор, пока полностью не сформируется мозг. После этого мозг, в первую очередь гипоталамус, начинает управлять работой гипофиза, а опосредовано через него и периферическими эндокринными железами, как и во взрослом организме [3—8].
В последние два десятилетия представления о роли мозга в нейроэндокринной регуляции в онтогенезе существенно изменились. Анализируя данные литературы и результаты собственных исследований, мы обратили внимание на то, что нейроны начинают синтезировать и выделять хи-
*Адресат для корреспонденции: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26, e-mail: zubova89@list.ru.
мические сигналы задолго до формирования межнейрональных синаптических связей и ГЭБ [9—12]. Это наблюдение послужило основанием для формулирования гипотезы, согласно которой мозг в онтогенезе до формирования ГЭБ, функционирует как эндокринный орган, выделяя в общую систему циркуляции физиологически активные вещества (ФАВ), и оказывает, таким образом, влияние на развитие и функционирование периферических органов и клеток-мишеней [13].
В ходе проверки гипотезы было показано, что до формирования межнейрональных синаптиче-ских связей и ГЭБ, т.е. у крыс до конца второй недели жизни, дифференцирующиеся нейроны секретируют гонадотропин-рилизинг гормон (ГРГ), дофамин (ДА) и серотонин, которые из мозга поступают в общую систему циркуляции, создавая в крови физиологически активную концентрацию [14—16]. Более того, было показано, что ДА, содержащийся в периферической крови, оказывает эндокринное влияние на лактотрофы гипофиза [17].
Среди большого количества химических сигналов, контролирующих развитие клеток — и органов-мишеней, одним из наиболее эффективных сигналов, обладающим широким спектром физиологического действия, является норадре-налин (НА), который синтезируется в основном нейронами головного мозга, а также перифериче-
ской симпато-адреналовой системой и вненадпо-чечниковой хромаффинной тканью.
Целью данной работы является продолжение проверки нашей гипотезы о развивающемся мозге как об эндокринном органе путем оценки возможности поступления НА в общую систему циркуляции в онтогенезе у крыс.
Задачами работы являлось определение:
1) динамики концентрации и содержания НА в общей системе циркуляции в онтогенезе — до и после формирования ГЭБ;
2) динамики концентрации НА в важнейших норадренергических центрах мозга — гипоталамусе и мезэнцефалоне-ромбэнцефалоне — до и после формирования ГЭБ;
3) изменения концентрации НА в крови после специфического хронического выключения синтеза НА в мозге неонатальных крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. Работа проведена на крысах линии Вистар — беременных самках, а также на самцах на 18-й эмбриональный день (Э18), Э21, на 2-й постнатальный день (П2), П3, П6, П15 и П30. Для получения датированной беременности к 3— 4 месячным самкам весом 200—250 г вечером подсаживали самцов, а утром брали влагалищные мазки. День обнаружения сперматозоидов в мазке считали первым днем беременности. День рождения крысят считали 1-ым постнатальным днем. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде.
В экспериментах по изучению динамики изменения концентрации НА в мозге и плазме крови в онтогенезе у крыс было использовано 39 плодов на Э18 от 5 беременных самок, 40 плодов на Э21 от 6 беременных самок, 32 животных на П2 от 4 пометов, 24 животных на П3 от 3 пометов, 20 животных на П15 от 3 пометов и 20 животных на П30 от 3 пометов.
Хроническое ингибирование синтеза НА в мозге крыс. Длительное (хроническое) фармакологическое выключение синтеза норадреналина в мозге у крыс проводили с помощью 6-гидроксидофа-мина (6-ГДА) — специфического нейротоксина катехоламинергических нейронов. В части экспериментов для предотвращения гибели дофаминер-гических нейронов, предварительно (за 60 минут) системно вводили GBR 12909 — ингибитор обратного захвата 6-ГДА в ДА-ергические нейроны, а, следовательно, нейропротектор этих нейронов [18]. Всего было использовано 32 животных.
В опыте (6 животных) 100 мкг 6-ГДА в 2 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой стерео-таксически вводили в боковой желудочек мозга. Для этого крысам под эфирным наркозом на голове разрезали кожу и латерально от брегмы вы-
резали в черепной коробке отверстие 2 х 2 мм. Затем животных помещали в стереотаксический прибор, адаптированный для молодых животных, и вводили стеклянную микроканюлю (диаметр 50 мкм), содержащую раствор для инъекции и соединенную тефлоновой трубкой с микрошприцем Hamilton, в боковой желудочек мозга по координатам 1.2 мм латерально от брегмы, 2.0— 2.5 мм вглубь мозга. Контрольным животным вводили 2 мкл 0.9 % NaCl (6 животных).
Взятие и обработка материала. У крыс через 24 или 72 часа после внутрижелудочковых инъекций 6-ГДА собирали кровь, мозг (одно полушарие), двенадцатиперстную кишку и надпочечники. На пробу приходился материал от одного животного.
Кровь переносили в пробирку, содержащую 30 мкл 5% раствора ЭДТА (Sigma) и 10 мкл l0% раствора метабисульфита натрия (Sigma). Затем отделяли плазму от форменных элементов центрифугированием при 400 g в течение 10 минут и добавляли в нее 250 пмоль/мл 3,4-дигидрокси-бензиламин гидробромида (ДГБА) — внутренний стандарт (Sigma) в 0.1 н HClO4. Для освобождения от высокомолекулярных белков плазму центрифугировали при 2000 g 20 минут, переносили в чистую пробирку и хранили при —70° С до определения катехоламинов.
Выделенные мозг и периферические органы гомогенизировали в 10 объемах 0.1 н HClO4, содержащей 500 пмоль/мл ДГБА, при помощи ультразвукового гомогенизатора (Labsonic M, Sarto-rius), центрифугировали при 2000 g в течение 20 мин и в полученном супернатанте определяли НА. Перед определением НА экстрагировали на оксиде алюминия.
Измерение НА в плазме крови и в полученных супернатантах ткани мозга и периферических органов проводили при помощи обратно-фазной ВЭЖХ (Amperometric detector LC-4B, Bioanalyti-cal Systems, США) при потенциале 850 мВ.
Пробы вводили в инжектор (Rheodyne 7125, США) с петлей объемом 100 мкл. Разделение производили на 10-сантиметровой колонке с внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18, 3.3 мкм (Dr. Maisch GmbH, Германия). Подвижной фазой служил 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0.3 мМ октансульфоната натрия (Sigma), 0.1 мМ ЭДТА (Sigma) и 8% ацето-нитрила (Sigma) (pH 3.0). Скорость потока 0.8 мл/мин обеспечивалась насосом (Gilson 307, Франция). Пики катехоламинов и метаболитов идентифицировали, ориентируясь на время выхода веществ в стандарте, содержание рассчитывали методом внутреннего стандарта, используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце, с помощью программы "Мульти-хром" (Россия).
■ Содержание НА в плазме, нг
-♦— Гипоталамус
35
30
25
20
«
и я
а тра
8 10
15
■ Концентрация НА в плазме, нг
■ Мезенцефалон/ромбоэнцефалон
14
- 12
10
- 8
- 4
6 *
&
о
ч о О
50 г
я
и ц
а тр
нт
/мл40 г/
н
е ц
н
о Ко
30
та20
о п и ~ 10
Э18 Э21 П3 П15 П30
- 100
- 90
- 80
- 70
- 60
- 50
- 40
- 30
ч - 20
10 0
П30
Ае Н ц
ия эн
ио цб рам
тр о
Е
ее цене
но ол
е ц
н е
Э18 Э21 П3 П15 П30
0
5
2
0
0
Рис. 1. Концентрация (сплошная линия) и содержание (пунктирная линия) норадреналина (НА) в плазме крови у интактных крыс на 18-й эмбриональный день (Э18), Э21, 3-й постнатальный день (П3), П15 и П30.
* Достоверные различия между каждым предыдущим и последующим значением концентрации НА на определяемых сроках (р < 0.05).
# Достоверные различия между содержанием НА на определяемых сроках (р < 0.05).
Рис. 2. Концентрация норадреналина (НА) в гипоталамусе (сплошная линия) и мезенцефалоне-ромбэн-цефалоне (пунктирная линия) у интактных крыс на 18-й эмбриональный день (Э18), Э21, 3-й постнатальный день (П3), П15 и П30.
* Достоверные различия между каждым предыдущим и последующим значением концентрации НА на определяемых сроках в гипоталамусе (р < 0.05).
# Достоверные различия между каждым предыдущим и последующим значением концентрации НА на определяемых сроках в мезенцефалоне-ромбэнцефа-лоне (р < 0.05).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.