ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 221-228
УДК 577.15,579.22,582.284
СЕЛЕКТИВНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОДУКЦИИ ИЗОФОРМ ЛАККАЗЫ
ГРИБОМ Lentinus strigosus 1566
© 2015 г. Н. М. Мясоедова*, Н. Б. Гасанов**, А. М. Черных*, М. П. Коломыцева*, Л.А. Головлёва*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: golovleva@ibpm.pushchino.ru **Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино Московской обл., 142290
Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Изучено влияние различных компонентов среды культивирования (пептон, дрожжевой экстракт, моно- и дисахариды, ионы меди, 2,6-диметилфенол и поликапроамидное волокно) на динамику активности лакказы в культуральной жидкости и продукцию ее изоформ грибом Lentinus strigosus 1566. Показано, что ряд сахаров избирательно индуцировали или ингибировали продукцию различных изоформ лакказы. Подобное действие оказывали ионы меди, 2,6-диметилфенол и поликапроамидное волокно, а также их комбинация. Селективная регуляция продукции определенных изоформ лакказ базидиальными грибами in vivo путем изменения состава компонентов среды культивирования может быть использована для различных биотехнологических целей.
Ключевые слова: Lentinus strigosus, изоформы лакказ, индукторы лакказ, сахара, иммобилизация.
Б01: 10.7868/80555109915020130
Лакказы (п-дифенол:кислород оксидоредукта-зы, КФ. 1.10.3.2.) — лигнинолитические внеклеточные ферменты, широко распространены в природе. Благодаря высокой стабильности и широкой субстратной специфичности лакказы нашли широкое применение в таких биотехнологических процессах, как модификация лигнинсодержащих биоматериалов, обесцвечивание волокна, тканей и бумаги, разложение красок, при обработке промышленных стоков, детоксикации ксенобиотиков, а также получении биополимеров, антиокси-дантов, противоопухолевых препаратов, антибиотиков, стероидов и других ценных соединений [1— 3]. Их используют при создании биосенсоров для определения различных фенольных соединений, кислорода, азидов, морфина, кодеина, катехола-минов и растительных флавоноидов [2]. Применяются лакказы и в пищевой промышленности для удаления фенольных соединений в напитках и выпечке, а также в косметических целях для обесцвечивания волос и кожи [1, 2].
Основной группой организмов, продуцирующих лакказы, являются базидиомицеты (грибы белой гнили), участвующие в разрушении лигнина [1]. Некоторые из них способны конститутивно синтезировать различные лакказы в процессе глубинного культивирования и увеличивать их синтез в присутствии индукторов. Другие — продуцируют лакказы только в присутствии индукторов [1, 4].
Широкое применение этих ферментов инициирует интенсивные исследования условий культивирования грибов белой гнили для получения лакказ или повышения уровня их природного синтеза путем внесения в среду культивирования ионов одно- и двухвалентных металлов, ароматических соединений, а также различных источников углерода и азота [1, 5, 6]. Однако влияние различных компонентов среды на продукцию грибами изоформ лакказы остается малоизученным.
Поскольку грибы способны синтезировать множественные изоформы лакказ с различными физико-химическими свойствами [4, 7—11], проблема достижения высокого уровня продукции этих ферментов с определенными свойствами для получения стабильных результатов в биотехнологических процессах остается актуальной до настоящего времени.
Ранее было показано, что ЬвпИпш strigosus 1566 является активным продуцентом ферментов с лакказной активностью при культивировании на среде с высоким содержанием углерода и азота в присутствии 2 мМ Си804 и 1.0 мМ 2,6-диметил-фенола в качестве индукторов [6]. Однако влияние как различных концентраций индукторов на динамику лакказной активности, так и компонентов среды на синтез изоформ фермента в процессе культивирования не было изучено.
Цель работы — изучение влияния различных соединений на уровень лакказной активности гриба L. strigosus 1566 и соотношение изоформ лакказы, образующихся в процессе погруженного культивирования.
МЕТОДИКА
Базидиальный гриб L. strigosus 1566 был получен из коллекции базидиомицетов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (БИН РАН, Россия). Культуру L. strigosus 1566 поддерживали на скошенном сусло-агаре при 29°С и хранили при 4°С.
В работе использовали 2,6-диметилфенол ("Sigma-Aldrich", США), 2,2'-азино-бис(3-этил-бензтиазолин-6-сульфоновая кислота) (АБТК, "Fluka", Германия), глицерин ("Serva", Германия), пептон ("BioMed", Россия), дрожжевой экстракт ("Pronadisa", Испания) и соевая мука ("Difco", США). Остальные реактивы были аналитической чистоты.
Инокулят L. strigosus 1566 выращивали при перемешивании (220 об./мин ) в медицинских колбах объемом 750 мл в течение 7 сут при 29°C в 150 мл соево-глицериновой среды (г/л): NH4NO3 — 0.2, KH2PO4 - 0.2, K2HPO4 - 0.02, MgSO4 ■ 7H2O - 0.1, пептон — 0.5, соевая мука — 0.5 и глицерин — 4.0, pH 5.0. Полученный мицелий гомогенизировали фарфоровыми бусами при перемешивании (220 об./мин) в течение 10 мин и вносили в медицинские колбы объемом 750 мл из расчета 10 мл гомогенизированного мицелия на 150 мл среды.
Погруженное культивирование осуществляли в среде (ПДМ), содержащей (г/л): пептон — 5.0, дрожжевой экстракт — 5.0 и MgSO4 ■ 7H2O — 1.0, при 220 об./мин и 29°C. Сахара (D-глюкозу, D-га-лактозу, L-арабинозу, D-ксилозу, сахарозу и мальтозу) добавляли в ПДМ среду перед внесением инокулята. Индукторы лакказы (2,6-диметилфе-нол и CuSO4) добавлялись после 4 сут культивирования гриба. В качестве индукторов использовали растворы 0.2 M CuSO4 и 1.5 M 2,6-диметил-фенол в диметилформамиде.
Для иммобилизации мицелия использовали 1 г поликапроамидного волокна на 150 мл среды.
Лакказную активность определяли по степени окисления 1.0 мМ АБТК (s436 = 29300 М—1см—1) в 20 мМ Na-ацетатном буфере, pH 5.0 [12]. Измерения проводили в кварцевой кювете (1 см) при 25°C на спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония) при 436 нм. За единицу активности лак-казы принимали скорость превращения 1 мкМ субстрата 1 мл культуральной жидкости за 1 мин.
Концентрацию глюкозы определяли модифицированным методом по реакции с фенолом [13].
Мицелий отделяли центрифугированием при 4000 % 15 мин, надосадочную жидкость разводили дистиллированной водой до конечной концентрации глюкозы 0.01 — 0.1 г/л. К 1 мл разведенной надосадочной жидкости добавляли 1.0 мл 5%-но-го водного раствора фенола и 5 мл концентрированной серной кислоты и инкубировали в течение 30 мин при 100°С. После охлаждения измеряли оптическую плотность раствора при 488 нм. Концентрацию глюкозы определяли, используя калибровочную кривую, построенную для растворов глюкозы с известной концентрацией (0.01-0.1 г/л).
Для определения сухой биомассы культураль-ную жидкость, содержащую грибной мицелий, фильтровали через бумажный фильтр. Фильтр с мицелием высушивали при 95°С до постоянной массы [14].
Электрофорез нативных ферментов проводили в 10%-ном ПААГ в отсутствие додецилсуль-фата натрия и меркаптоэтанола по модифицированному методу Лэмли [15]. Для специфического окрашивания оксидаз использовали раствор 0.1%-ного о-дианизидина в 1%-ной уксусной кислоте или 1 мМ АБТК.
Из проб культуральной жидкости (3 мл), отобранных на различных этапах развития гриба, отделяли мицелий центрифугированием при 4000 % в течение 15 мин. Белки, присутствующие в надосадочной жидкости (2 мл), осаждали равным объемом охлажденного ацетона (2 мл) в течение 20 мин при 4°С. Осадок отделяли центрифугированием в тех же условиях, растворяли в 100 мкл 20 мМ ^-ацетатного буфера, рН 5.0, и смешивали с буфером для ПААГ-электрофореза. В ряде случаев для лучшей визуализации ферментных зон с оксидазной активностью готовили образцы с различным соотношением раствора белка и буфера для нативного электрофореза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние источников углерода на лакказную активность, динамику образования изоформ лакказы и их соотношение в культуральной жидкости гриба
Ь. strigosus 1566. В качестве факторов, увеличивающих продукцию грибных лакказ, были протестированы моносахариды (глюкоза, галактоза, арабиноза и ксилоза) и дисахариды (сахароза и мальтоза). Как видно из данных, приведенных на рис. 1, все исследованные сахара вызывали увеличение лакказной активности в культуральной жидкости гриба Ь. strigоsus 1566 по сравнению с контролем, не содержащем сахара.
Наиболее высокая лакказная активность наблюдалась при культивировании Ь. strigоsus 1566 в присутствии галактозы, арабинозы и ксилозы (рис. 1). При этом активность достигала макси-
мального уровня на 14 сут развития гриба. Присутствие в среде глюкозы или одного из дисахари-дов (сахарозы или мальтозы) снижало уровень лакказной активности. Однако ее максимум наблюдался в тот же промежуток времени (рис. 1). При этом сахароза индуцировала более раннее появление лакказной активности в культураль-ной жидкости L. strigosus 1566, в отличие от мальтозы (рис. 1). На среде с глюкозой лакказная активность в культуральной жидкости была ниже, чем на средах с другими моносахаридами (галактоза, ксилоза или арабиноза), но выше, чем в присутствии дисахаридов (рис. 1).
Полученные результаты согласуются с ранее описанными данными для ряда других грибов, свидетельствующими о стимуляции секреции лак-казы на средах с углеводами [4, 16—21]. Однако влияние различных сахаров на секрецию лакказы у грибов изучено в настоящее время недостаточно [16, 18, 19, 21].
Были показаны избирательность базидиально-го штамма L. strigosus 1566 по отношению к ряду моно- и дисахаридов и их влияние на состав изо-форм лакказы, секретируемых в культуральную жидкость (рис. 2). В ходе культивирования (22 сут) в ПДМ среде штамм продуцировал в основном три изофермента (I, II и III), окисляющих o-диа-низидин (рис. 2, треки 1—4) и АБТК (данные не приводятся), что свидетельствовало о том, что продуцируемые ферменты обладали лакказной активностью. Добавление в ПДМ среду в начале культивирования гриба моно- или дисахаридов приводило к избирательному синтезу этих окси-даз в различные промежу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.