ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 9, с. 1255-1262
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.17:616-0567:616.153922
СЕМЕЙНАЯ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЯ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ: РАЗНООБРАЗИЕ МУТАЦИЙ СВИДЕТЕЛЬСТВУЕТ ОБ ОТСУТСТВИИ ВЫРАЖЕННОГО ЭФФЕКТА ОСНОВАТЕЛЯ
© 2007 г. Ф. М. Захарова1, Ю. А. Татищева1, В. И. Голубков1, Б. М. Липовецкий2, В. О. Константинов3, А. Д. Денисенко1, О. Фаергеман4, В. Б. Васильев1, М. Ю. Мандельштам1
1 Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук, Санкт-Петербург 197376; факс (812) 234-94-89; e-mail: f.zakharova@vz5518.spb.edu 2 Институт мозга Российской академии наук, Санкт-Петербург 197376 3 Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова,
кафедра госпитальной терапии, Санкт-Петербург 195067 4 Отделение клинической биохимии, госпиталь Университета г. Орхус, Дания DK-8000
Поступила в редакцию 31.07.2006 г.
В группе пациентов с семейной гиперхолестеринемией (СГ) 74 пробандов из Санкт-Петербурга при изучении всей кодирующей последовательности гена рецептора липопротеина низкой плотности (ЛНП), его промотора и большинства экзон-интронных стыков было идентифицировано 34 различные мутации и 8 широко распространенных полиморфизмов этого локуса. Лишь четыре из найденных мутаций мы склонны считать нейтральными вариантами, а остальные 30, по всей видимости, являются причиной развития семейной гиперхолестеринемии (СГ). Суммарно мутации гена рецептора ЛНП, вызывающие заболевание, были выявлены в 41 (55%) из 74 исследованных семей с СГ. Мутация R3500Q в гене аполипопротеина В (APOB) у всех пробандов не была обнаружена, и, по-видимому, гиперхолестеринемия в семьях без мутаций вызвана интронными мутациями в гене рецептора ЛНП или какими-то другими генетическими факторами. Из числа обнаруженных мутаций, определяющих развитие заболевания, 19 были впервые описаны в Санкт-Петербурге, а 18 из них являются специфичными исключительно для России. Среди евреев-ашкенази Санкт-Петербурга обнаружена одна мажорная мутация G197del, выявленная приблизительно у 30% (7/22) пациентов с СГ из этой этнической группы. Среди славянского населения Санкт-Петербурга отсутствовали мажорные мутации: лишь 5 мутаций были идентифицированы в двух семьях, а 24 были найдены в единичных семьях. Эти данные свидетельствуют об отсутствии выраженного эффекта основателя при СГ в популяции Санкт-Петербурга.
Семейная гиперхолестеринемия (СГ) (ОМ1М #143890) является одним из наиболее распространенных моногенных заболеваний: ее частота в популяциях людей белой расы составляет 1 случай на 500 человек [1]. СГ - это одна из наиболее ярко выраженных наследственных детерминант, определяющих развитие атеросклероза, ишеми-ческой болезни сердца и последующих инфарктов миокарда. Причиной является снижение скорости катаболизма липопротеинов низкой плотности (ЛНП) вследствие количественной недостаточности или дисфункции их специфического рецептора (*606945), вызванное мутациями в кодирующем его гене. К настоящему времени в мире описано более 1000 мутаций этого локуса, приводящих к развитию СГ [2-5]. Показано, что спектры мутаций этого гена существенно отличаются в разных популяциях и этнических группах. К моменту начала наших исследований (Мандельштам и др.,
1989) не имелось данных о мутационном спектре при СГ в России, и поэтому целью нашей работы стало изучение молекулярных основ этого тяжелого заболевания в Санкт-Петербурге.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследования были отобраны пациенты с клиническим диагнозом СГ по критериям, описанным ранее [6, 7]. Геномную ДНК выделяли из крови по стандартной методике [8]. Для детекции мутации R3500Q (с. 10658 G > А; CGG > CAG) в гене АРОВ был использован метод сайт-направленного мутагенеза, создающего искусственно в процессе ПЦР сайт рестрикции для эндонуклеазы MspI в случае нормального, но не мутантного ал-леля [9]. Все 18 экзонов и промоторная область гена рецептора ЛНП были амплифицированы с помощью праймеров, синтезированных по опуб-
AAGGCTGTCGTAAGTGTGG
AAGGCTGTCRTAAGTGTGG
TTCCGACAGYATTCACACC
Рис. 1. Идентификация мутации IVS3 + 1G>A с помощью автоматического секвенирования ДНК. Приведены последовательности кодирующей (вверху) и не-кодирующей нитей (внизу) ДНК с мутацией в гетерозиготном состоянии. В самой верхней части рисунка приведена нормальная последовательность кодирующей нити гена рецептора ЛНП человека. Стрелками на рисунках показано положение нуклеотидной замены. R в подписи обозначает пурин, т.е. G или A, а Y -пиримидин, т.е. T или C.
ликованным последовательностям [10, 11], и продукты ПЦР были исследованы в полиакриламид-ном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием бромистым этидием или серебром для исключения неспецифической амплификации. Анализ конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ) проводили в 4.25% неденатурирующем MDE-ПААг (mutation detection enhancement gel) (Cambrex) при 20°C на секвенаторе ДНК ABI 377 (PE-Applied Biosystems) или в 6-12% ПААГ с последующим окрашиванием ДНК серебром [12]. Автоматическое секвени-рование ДНК проводили на секвенаторе ABI 377 (PE-Applied Biosystems) и частично на приборе ALFExpress-2 ("Amersham Biosciences") с использованием праймеров для обычной ПЦР. При исследовании образцов ДНК, несущих короткие де-леции и инсерции, продукты ПЦР были клонированы в векторе pBluescript, входящем в состав коммерческого набора "ТАКЛОН" ("Медиген", Новосибирск), а далее их последовательность определяли с помощью секвенирующих праймеров, отжигающихся с плазмидой (forward и reverse).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для изучения спектра мутаций в гене рецептора ЛНП в Санкт-Петербурге нами была создана коллекция ДНК, включавшая 74 образца от про-бандов с диагнозом СГ. Присутствие мутации R3500Q в гене APOB было исключено у всех про-
бандов с помощью рестрикционного теста. Ранее было показано, что большие геномные изменения не характерны для пациентов с СГ в Санкт-Петербурге [13, 14], и они были исключены у большинства пробандов в исследуемой группе. Поэтому мы сосредоточили свое внимание на поиске точечных мутаций и небольших делеций и инсерций. Для этого амплифицировали все экзо-ны гена рецептора ЛНП с прилежащими областями интронов, а далее образцы подвергали либо прямому секвенированию по двум нитям, либо изучали путем высокочувствительного флуоресцентного анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-ана-лиз). В качестве примера на рис. 1 показана идентификация мутации в донорном сайте интрона 3 с помощью автоматического секвенирования ДНК. В результате исследований было обнаружено 34 мутации и 8 ДНК-полиморфизмов в гене рецептора ЛНП (табл. 1). Девятнадцать мутаций из числа найденных были описаны впервые в мире [4, 5]. Для идентификации всех мутаций были разработаны быстрые методы их выявления, сведения о которых для каждой мутации приведены в табл. 1. Мутации гена рецептора ЛНП, предположительно вызывающие заболевание, были выявлены в 41 из 74 (55%) исследованных семей с СГ. С помощью быстрых методов поиска мутаций мы провели исследование ДНК 69 родственников пробандов и обнаружили мутации у 26 из них, а также исключили наличие мутаций у 43. В большинстве случаев для выявления мутаций в семьях пробандов удалось разработать хорошо воспроизводимые и недорогие процедуры тестирования: рестрикционный анализ (рис. 2, табл. 1) или гетеродуплексный анализ (рис. 3, табл. 1), которые могут быть использованы во многих диагностических лабораториях страны.
ОБСУЖДЕНИЕ
В наших предыдущих работах [13, 14] у 50 пробандов с СГ при исследовании их ДНК методом гибридизации по Саузерну была обнаружена лишь одна делеция в гене рецептора ЛНП и тем самым показано, что крупные перестройки этого локуса у жителей Санкт-Петербурга встречаются редко (приблизительно у 2%, или 1/50). Эти данные совпадали с результатами, полученными в других смешанных популяциях, в большинстве из которых, как и в мире в целом, в гене рецептора ЛНП преобладают точковые мутации и короткие делеции, а не крупные делеции и инсерции. Так, например, в Англии [15] большие делеции в гене рецептора ЛНП были обнаружены примерно у 6% пациентов с СГ (4 из 70 пациентов), а среди англоязычных канадцев - лишь у 2.5% (6 из 234 пациентов) [16]. Таким образом, в России внимание
Таблица 1. Мутации в гене рецептора липопротеинов низкой плотности у больных семейной гиперхолестерине-мией - жителей Санкт-Петербурга
Изменение Число семей
Мутация в нуклеотидной Экзон/интрон Быстрый метод анализа (пациентов)
последовательности с мутацией
Большие делеции
delta 5кЬ* Большая делеция экзоны 3-5 Гибридизация по Саузерну 1 (2)
Миссенс-мутации
C127W* с.444 T>G экзон 4 Новый сайт MvaI 1 (1)
А130Р* с.451 G>C экзон 4 Утрата сайта Сас81 1 (1)
С1390* с.478 T>G экзон 4 Новый сайт MspI 1 (3)
С146Я* с.499 Т>С экзон 4 Новый сайт ApaI 1 (3)
C188Y* с.626 G>A экзон 4 Новый сайт RsaI 1 (3)
C308Y с.985 G>A экзон 7 Новый сайт FblI 2 (2)
L380H с.1202 Т>А экзон 9 Утрата сайта МпИ 1 (1)
D601N* с.1864 G>A экзон 13 Утрата сайта EcoRV 1 (2)
0571Е с.1775 G>A экзон 12 SSCP 1 (1)
C646S* с.1999 Т>А экзон 14 SSCP 1 (1)
V776M с.2389 G>A экзон 16 SSCP 1 (2)
V806I с.2479 G>A экзон 17 Нет 1 (1)
Нонсенс-мутации
012Х с.97 С>Т экзон 2 Новый сайт MaeI 1 (2)
С74Х с.285 С>А экзон 3 Новый сайт DdeI 1 (1)
Е207Х с.682 G>T экзон 4 Новый сайт MaeI 1 (2)
С249Х* с.810 С>А экзон 5 Новый сайт DdeI, 1 (1)
утрата сайта Fnu4Ш
Е397Х* с.1252 С>Т экзон 9 Новый сайт АМ 1 (7)
W422X* с.1328 G>A экзон 9 Новый сайт MaeI 2 (2)
Мутации инвариантных сайтов сплайсинга
^3 + 10>А с.313 + 1G>A интрон 3 SSCP 2 (3)
IVS9 + 10>А с.1358 + Ш>А интрон 9 Утрата сайта AsuHPI 1 (1)
Мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания
FsK202: S206X* c.670-671insG экзон 4 SSCP 1 (2)
FsE287: V348X c.925-931del7 экзон 6 SSCP 1 (1)
FsE291: Ю09Х* c.936-940del5 экзон 6 SSCP 1 (1)
FsV409: S423X* c.1291-1331del41 экзон 9 Гетеродуплексы 1 (3)
FsE414: М429Х c.1302delG экзон 9 SSCP 1 (1)
FsV597: А622Х* c.1855-1856insA экзон 13 Нет 1 (1)
Делеции, не нарушающие рамку считывания
347de
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.