ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2012, том 31, № 10, с. 15-20
ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 535.71
СЕНСОРНЫЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ LUX-ОПЕРОНОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ТОКСИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ © 2012 г. Г. Б. Завильгельский*, В. Ю. Котова, И. В. Манухов
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва *E-mail: zavilgel@genetika.ru Поступила в редакцию 14.10.2011
На основе бактерий Escherichia coli сконструированы высокочувствительные специфические lux-биосенсоры для детекции ионов металлов и металлоидов (ртуть, кадмий, серебро, медь, мышьяк, сурьма), а также алкилирующих агентов. Бактерии содержат гибридные плазмиды pArsR'::lux, pMerR'::lux, pCopA'::lux, pAlkA'::lux, в которых транскрипция генов-репортеров luxCDABE Photo-rhabdus luminescens осуществляется с индуцируемых промоторов: ars-оперона, mer-оперона, гена copA и гена alkA соответственно. Проведено измерение основных характеристик (пороговая чувствительность, амплитуда и время ответа) lux-биосенсоров. Показано, что окисление 1,1-диметил-гидразина перекисью водорода приводит к появлению в клетке алкилирующих соединений, обладающих сильным генотоксичным действием.
Ключевые слова: биосенсор, люцифераза, биолюминесценция, индуцируемый промотор.
ВВЕДЕНИЕ
Lux-биосенсоры широко используются в работах по генетической инженерии и биотехнологии, а также для мониторинга окружающей среды [1—4]. Lux-биосенсор — это бактериальная клетка, содержащая гибридную плазмиду, в состав которой встроены два основных элемента: регуляторный участок (промотор и оператор) и ген(гены)-ре-портер(ы) (рис. 1). В качестве генов-репортеров используются гены luxCDABE, кодирующие лю-циферазу и редуктазу. В качестве регуляторных элементов используются различные индуцируемые промоторы, сформированные в процессе эволюции и специфически реагирующие на наличие в среде определенного вида химического вещества. Данная группа биосенсоров характеризуется как специфичностью, так и высокой чувствительностью, что определяется особенностью взаимодействия белка-рецептора (репрессора или активатора транскрипции) с химическим веществом.
Бактериальные люциферазы являются гетеро-димерами (состоят из а- и Р-субъединиц) и катализируют окисление длинноцепочечного альдегида RCHO (природный субстрат — тетрадеканаль) кислородом воздуха с помощью восстановленного флавин-мононуклеотида:
FMNH2 + RCHO + O2 = = FMN + H2O + RCOOH + hv.
Реакция сопровождается высвечиванием кванта сине-зеленого света (Нутах при 490 нм).
В геномах люминесцирующих бактерий гены, кодирующие люциферазу, расположены в составе оперона /ихСЭАББ. Гены /ихАБ определяют синтез субъединиц люциферазы, а гены /ихСЭБ определяют синтез субъединиц редуктазы, ответственной за формирование субстрата люцифера-зы — тетрадеканаля в результате восстановления жирной кислоты [5].
ter
co RV Cla I
Cla I
1ихБ
Рис. 1. Структура гибридной плазмиды /их-биосенсо-ра. Плазмида содержит гены-репортеры и регулятор-ный элемент. Гены /ихСВАББ — гены-репортеры, ор — регуляторный элемент.
При конструировании /ux-биосенсоров на основе клеток Escherichia co/i оптимальным является клонирование в плазмиде-векторе полного /ux-оперона — /uxCDABE (используются опероны, изолированные из хромосом морских бактерий Vibrio fischeri, Vibrio harvey, Photobacterium /eiog-nathi и наземных бактерий Photorhabdus /umine-scens, так как в этом случае к клеткам биосенсора не нужно добавлять субстрат люциферазной реакции — алифатический альдегид). В настоящей работе в качестве генов-репортеров используются гены /uxCDABE, изолированные из генома наземных бактерий Photorhabdus /uminescens.
Свечение клеток фиксируется фотоумножителем. Принципиально важно, что интенсивность свечения прямо пропорциональна количеству активных люцифераз, причем в широком диапазоне концентраций фермента (более шести порядков). Эта особенность люциферазной реакции дает возможность использовать сконструированные /ux-биосенсоры не только для качественного детектирования наличия токсических агентов в среде, но и для количественного анализа.
У бактерий можно выделить регуляторные системы, специфически реагирующие на токсические агенты, действующие на клеточные мембраны, белки, хромосому (ДНК), а также индуцирующие в клетке окислительный стресс. Кроме того, бактерии имеют регуляторные системы, специфически реагирующие на ионы металлов и мышьяка.
В настоящей работе проведены конструирование и сравнительный анализ основных параметров группы lux-биосенсоров, специфически реагирующих на ионы меди, серебра, ртути, кадмия, мышьяка и сурьмы. Представлены основные параметры этих биосенсоров и биосенсоров, сконструированных нами ранее.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы и плазмиды
В работе использовали штаммы Escherichia co/i K12: MG1655 F- i/vG rfb-50 rph-1; MC1061 F-araD139 A(ara /eu)7697 A/acX74 thi ga/Uga/K hsdR mcrB rpsL; TG-1 thi re/A supE44 hsdR17 hsdM A/ac-proAB) [F'traD36proAB /acIqZ AM15]; AB1157 F-thr-1 /eu-6 proA2 his-4 thi-1 argE3 /acY1 ga/K2 ara14 xy/-5 mt/-1 tsx-33 rpsL31 supE44. Плазмиды — векторы: pTZ57R фирмы "Fermantas", pDEW201 получен от T.K. Van Dyk (США) [3].
Питательные среды
Бактерии растили в бульоне Луриа—Бертани (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина.
Ферменты и химические вещества
Все химические препараты были аналитической чистоты. В качестве индукторов использовали соли: NaAsO2, мета-арсенит "Aldrich Sigma"; HgCl2, AgNO3, CuSO4, а также алкилирующий агент 1-метил-3-нитро-1-нитрозогуанидин (МННГ) и 1,1-диметилгидразин ("Merck"). Ферменты для работы с ДНК получены от фирмы "Fermentas" (Литва). Все тест-растворы приготовляли непосредственно перед их использованием.
Операции с ДНК
Выделение ДНК плазмид, рестрикцию, лиги-рование фрагментов ДНК, трансформацию клеток проводили согласно [6].
Измерение люминесцентной реакции lux-биосенсоров
Ночную культуру биосенсора разводили до концентрации 107 клеток/мл в свежем ЬБ и растили с аэрацией при 30°С до ранней экспоненциальной фазы. Затем пробы по 200 мкл переносили в специальные кюветы, одна из которых была контрольной (в нее добавляли 4 мкл дистиллированной воды), а в другие кюветы вносили по 4 мкл химических веществ в различной концентрации. Приготовленные таким образом пробы с клетками /их-биосенсора располагали перед фотоумножителем в люминометре и через определенные интервалы времени измеряли интенсивность биолюминесценции клеточной суспензии. Инкубацию проб проводили при комнатной температуре. Измерение интенсивности биолюминесценции проводили согласно [7—9].
Измеряли три основных параметра, характеризующих качество биосенсора: 1) амплитуду ответа (АО), 2) минимальное время ответа (,т) и 3) пороговую чувствительность. В общем виде АО определяется по следующей формуле: Я = (I, — —/0)/(4 — /0), где 10 — интенсивность биолюминесценции препарата в момент добавления индуктора (, = 0), 1к — интенсивность биолюминесценции контрольного препарата (отсутствие индуктора) в момент ,, I, — интенсивность биолюминесценции опытного препарата в момент Минимальное время ответа ,т определяется интервалом времени между моментом добавления индуктора и моментом фиксации прибором (люминометром) достоверного усиления сигнала по сравнению с (1к — /0). Пороговая чувствительность определяется минимальной концентрацией индуктора, при которой Я = 2.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Конструирование гибридных плазмид
1.рАгзЯ'гЛих. Основным элементом гибридной плазмиды является ген агаЯ, кодирующий белок-репрессор ага-оперона (аг-оперон определяет резистентность бактерий к ионам мышьяка и сурьмы). ДНК-фрагмент (613 п.н.), содержащий ген агаЯ с собственными промотором и оператором, с помощью (полимеразной цепной реакции) (ПЦР) амплификации со стандартными прямым и обратным праймерами был изолирован из плазмиды pSЯ13. Плазмида pSЯ13 состоит из вектора риС19 и фрагмента ДНК из трансмиссивной плазмиды Я64 (1пс11) с геном огеЯ [10]. "Липкие" концы фрагмента были заполнены с помощью фрагмента Кленова. Встраивание фрагмента в вектор pDEW201 проводили по сайту $ша1. В результате была сконструирована гибридная плазмида рАгзЯ::1их (плазмида, в которой гены, кодирующие люциферазу, транскрипционно слиты с индуцируемым промотором (РАг8Я)).
2. рМвгЯ'::/их. Основным элементом гибридной плазмиды является ген твгЯ, кодирующий белок-активатор твг-оперона (твг-оперон определяет резистентность бактерий к ионам ртути и кадмия). ДНК-фрагмент (712 п.н.), содержащий ген твгЯ с промотором оперона merTPFAD, был с помощью ПЦР амплификации с праймерами изолирован из плазмиды рКЬИ53.1 Арг Щг. Плазмида рКЬИ53.1 состоит из вектора риС19 и фраг-
мента ДНК c mer-опероном merRTPFAD из ртутного транспозона Tn5053 [11]. "Липкие" концы фрагмента были заполнены с помощью фрагмента Кленова. Встраивание фрагмента в вектор pDEW201 проводили по сайту SmaI. В результате была сконструирована гибридная плазмида pMerR'::lux.
3. pCopA'::lux. ДНК-фрагмент, содержащий промотор PcopA и регуляторный участок, был получен при помощи ПЦР амплификации соответствующей нуклеотидной последовательности из генома E. coli K12 MG1655 с использованием праймеров
copArev 5' - GCTGTTCTGCACTGGCAGTCCC - 3' (2352),
copAdir 5' - GGTGTAAGCCTGATCCACTGCCT - 3' (2792).
Полученный ПЦР-продукт был клонирован в вектор pTZ57R. Далее фрагмент ДНК, фланкированный сайтами рестрикции EcoR1 и BamH1, встраивали по указанным сайтам в беспромотор-ный мультикопийный вектор pDEW201.
4. pAlkA'::lux. ДНК-фрагмент, содержащий промотор PalkA и регуляторный участок, был получен при помощи ПЦР амплификации соответствующей нуклеотидной последовательности из генома E. coli K12 MG1655 с использованием праймеров
alkArev 5' - GAGCAGCGAAATTTCATCCCAACATCCACGACC - 3' alkAdir 5' - GACTTAAGGATCCGCAAGGCATTGAAGGCAG - 3'.
Полученный ПЦР-продукт был клонирован в вектор pTZ57R. Далее фрагмент ДНК, фланкированный сайтами BamH1, встраивали по указанному сайту в беспромоторный мультикопийный вектор pDEW201. Сконструированные гибридные плазмиды вводили путем трансформации в клетки различных штаммов E.coli K12
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.