БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 4, с. 231-237
УДК 612.17
СЕРОВОДОРОД В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИМОСТИ МИОКАРДА ЛЯГУШКИ
© 2012 г. Н. Н. Хаертдинов1, Д. Р. Ахметшина1, А. Л. Зефиров2, Г. Ф. Ситдикова1*
1Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008Казань, ул. Кремлевская, 18; *электронная почта: Guzel.Sitdikova@ksu.ru 2Казанский государственный медицинский университет Министерство здравоохранения и социального развития РФ,
420012 Казань, ул. Бутлерова, д.42 Поступила в редакцию 25.06.2011 г.
После доработки 19.10.2011 г.
Сероводород (H2S) наряду с оксидом азота (NO) и монооксидом углерода (СО) относится к эндогенно синтезируемым газообразным молекулам. Он оказывает целый ряд эффектов в сердечно-сосудистой системе как в норме, так и при различных патологических состояниях. С помощью метода тензометрии исследовали влияние и механизмы действия донора H2S — гидросульфида натрия (NaHS) — на сократимость миокарда лягушки. NaHS в концентрации 100 мкМ оказывал отрицательный инотроп-ный эффект, уменьшая максимальную скорость укорочения и расслабления полоски. Аналогичное действие оказывал субстрат эндогенного синтеза H2S — Z-цистеин (200 и 1000 мкМ), тогда как блока-торы цистатионин-у-лиазы, вовлеченной в синтез H2S,— в-цианаланин (500 мкМ) и пропаргилгли-цин (500 мкМ) усиливали сократимость миокарда. В условиях блокирования цистатионин-у-лиазы в-цианаланином отрицательный инотропный эффект Z-цистеина не проявлялся. При ингибирова-нии аденилатциклазы MDL-12,330A (3 мкМ) и фосфодиэстераз IBMX (200 мкМ) эффект NaHS был менее выражен, чем в контроле. На фоне действия проникающих через мембрану аналогов cAMP — 8Br-cAMP (100 мкМ) и pCPT-cAMP (100 мкМ) отрицательный инотропный эффект NaHS сохранялся полностью. Предварительная аппликация донора NO — SNAP (10 мкМ) — значительно снижала выраженность эффекта NaHS, тогда как в условиях блокирования NO-синтаз (LNAME, 100 мкМ) влияние NaHS на сократимость миокарда не изменялось. Полученные данные предполагают возможность эндогенного синтеза H2S в миокарде лягушки и регуляцию сократимости миокарда через активацию фосфодиэстераз, гидролизующих cAMP, что приводит к снижению активности cAMP-зависи-мых протеинкиназ и фосфорилирования потенциал-зависимых Са-каналов L-типа. В результате уменьшается вход ионов Са в кардиомиоциты и снижается сила сокращения миокарда.
Ключевые слова: сероводород, сократимость миокарда, аденилатциклаза, оксид азота.
Сероводород (И28) давно известен как токсичный газ [1], однако все больше данных свидетельствует о том, что И28 синтезируется эндогенно и оказывает различные физиологические эффекты в сердечно-сосудистой и нервной системах, а также в желудочно-кишечном тракте [2—7]. Предполагается, что И28 является эндогенным "газомедиатором", как и два других физиологически активных газа — оксид азота (N0) и монооксид углерода (СО) [8, 9]. В сердечно-сосудистой системе И28 синтезируется из Х-цистеина цистати-онин-у-лиазой и 3-меркаптосульфотрансферазой [5, 10, 11], где влияет на вазодилятацию, регуляцию пролиферации и апоптоза, ангиогенез. Кроме этого, И28 оказывает кардиопротекторное действие при повреждениях, связанных с ишеми-ей—реперфузией [5, 10, 12]. Интересно, что И28 влияет на сосудистый тонус позвоночных всех классов (рыб, амфибий, рептилий), включая ва-зоконстрикцию и вазодилятацию, что указывает
на филогенетическую древность И28 как газомедиатора и универсальность его действия [13, 14].
На целом сердце и изолированных кардиомио-цитах крысы показано, что И28 уменьшает длительность потенциала действия и оказывает отрицательный инотропный эффект [10, 15, 16]. Механизмы действия И28 в миокарде млекопитающих включают, по разным данным и в зависимости от вида животного, систему аденилатциклазы, АТР-зависимые К-каналы и потенциал-зависимые Са-каналы Ь-типа [11, 15—17]. Регуляция синтеза сАМР при воздействии И28 может играть важную кардиопротекторную роль, тем более что отмечено значительное снижение продукции И28 в различных моделях ишемии и сверхстимуляции р-адре-норецепторов [10, 12]. В миокарде лягушки донор сероводорода оказывал дозозависимый от-
рицательный инотропный эффект [18], однако механизмы действия И28 не выявлены.
120
50 мг J 400 мс
я
и
х
(D
3
cd &
о
с
U
100
80
60
40
20
контроль Z-цистеин
«fe
120
§ 100 н
е
с?
cd р
кр
о
с
<3
и
80
60
40
20
10 мин
15
20
Ж
Ж
0
0
5
Рис. 1. Влияние субстрата и блокаторов синтеза сероводорода на сократимость миокарда. а — Динамика изменения силы сокращения при действии субстрата синтеза Б^ Ь-цистеина в концентрации 1 мМ. Вверху показаны оригинальные записи сокращений в контроле и при действии Ь-цистеина к 20 мин аппликации. б — Изменение силы сокращения миокарда при действии 1 мМ Х-цистеина (1) и блокаторов цистатионин-у-лиазы — 500 мкМ Р-цианаланина (2) и 500 мкМ пропаргилглицина (3). *р < 0.05
Цель настоящей работы состояла в исследовании эффектов экзогенного и эндогенного И28 на сократимость миокарда лягушки и выявление возможных молекулярных механизмов его действия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты по регистрации сократимости проводили на полосках миокарда лягушки с помощью установки PowerLab с изометрического тензодатчика чувствительностью 0—50 г. (AD Instrument, Австралия, и Biopac, США). Полоску желудочкового миокарда длиной 4—6 мм и диаметром 1 мм вертикально погружали в резервуар с рабочим объемом 20 мл и перфузировали раствором Рингера для холоднокровных животных, содержащим (мМ): 118.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 10Trizma (pH 7.3—7.4, 20°C). Препарат стимулировали электрическими импульсами с частотой 0.1 Гц через два серебряных электрода. Сигналы обрабатывали с помощью программы Chart, силу сокращения определяли в граммах. Оценивали амплитуду сокращения, а также максимальные скорости укорочения и расслабления. Статистический анализ проводили с помощью стандартных методов, статистическую значимость различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
В качестве донора H2S использовали гидросульфид натрия (NaHS), который в водном растворе диссоциирует на Na2+ и HS-, затем HS- связывается с H+ с образованием H2S. В нейтральном растворе одна треть NaHS находится в виде газа H2S, а две трети — в виде HS- [1]. В экспериментах
использовали также Z-цистеин, Р-цианаланин, пропаргилглицин, IBMX (3-изобутил-1-метилк-сантин), 8Br-cAMP, pCPT-cAMP (натриевая соль 8-(4-хлорфенилтио)аденозин-3',5'-аденозинцикло-фосфата), MDL-12.330A (гидрохлорид цис-^-(2-фе-нилциклопентил)-азациклотридец-1-ен-2-амина), LNAME (метиловый эфир №-нитро-Х-аргини-на), SNAP ^-нитрозо-^ацетилпеницилламин). Вещества, нерастворимые в воде, растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Концентрация DMSO в используемых растворах не превышала 0.01%. В такой концентрации DMSO в контрольных экспериментах не влиял существенно на силу сокращения миокарда. Все использованные вещества были фирмы Sigma (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние донора, субстрата и блокаторов синтеза H2S на силу сокращения миокарда. №И8, донор И28, в концентрации 100 мкМ вызывал обратимое снижение амплитуды сокращения полоски желудочка сердца лягушки до 66 ± 6% (п = 14,р < 0.05) к 20 мин аппликации, что согласуется с ранее полученными данными [18]. При этом №И8 уменьшал максимальные скорости укорочения и расслабления полоски миокарда до 57 ± 8 и 53 ± 7% (п = 5, р < 0.05) по отношению к контролю соответственно. Субстрат синтеза И28 — Х-цистеин — в концентрации 200 мкМ вызывал, подобно донору газа, снижение амплитуды сокращения полоски миокарда до 83 ± 6% (п = 6, р < 0.05), а в концентрации 1 мМ — до 58 ± 4% (п = 7, р < 0.05) к 20 мин аппликации (рис. 1а, б).
*
1201- ,—
Я
о
¡3
св
л м о о св
К
Ен
Ч С
100
80
60
40
20
КаШ МБЬ-12,330Л
МБЬ-12,330Л + КаШ
1ВМХ
1ВМХ + КаШ
рСРТ-сЛМР
рСРТ-сЛМР + КаШ
*
*
*
0
Рис. 2. Влияние гидросульфида натрия в условиях понижения и повышения уровня циклических нуклеотидов. Представлены амплитуды сокращения миокарда при действии КаН8 (100 мкМ) в контроле, МВЬ-12,330Л (3 мкМ), 1ВМХ (200 мкМ), рСРТ-сЛМР (100 мкМ) и №Н8 на фоне действия указанных агентов. При анализе эффектов №Н8 за 100% принимались значения, полученные на фоне действия МВЬ-12,330Л, 1ВМХ, рСРТ-сЛМР соответственно. *р < 0.05
Для выявления возможности эндогенного синтеза газа использовали блокаторы цистатио-нин-у-лиазы р-цианаланин и пропаргилглицин в концентрации 500 мкМ. р-Цианаланин повышал силу сократимости миокарда до 117 ± 6% (п = 8, р < 0.05), а пропаргилглицин — до 112 ± 3% (п = 8, р < 0.05) к 15 мин аппликации (рис. 1б). Таким образом, эндогенно синтезируемый Н28 вызывал такие же эффекты, как и апплицируемый экзо-генно, а блокаторы цистатионин-у-лиазы оказывали противоположное действие. В условиях блокирования цистатионин-у-лиазы р-цианаланином аппликация Х-цистеина (200 мкМ или 1 мМ) не приводила к снижению амплитуды сокращения.
Аденилатциклазная система и эффекты Н2Б в миокарде. В нервной системе и кардиомиоцитах теплокровных животных эффекты Н28 могут опосредоваться изменением уровня сЛМР [11, 19], поэтому изучали влияние газа в условиях повышения и понижения уровня этого циклонуклео-тида. Ингибирование аденилатциклазы с помощью МЭЬ-12.330Л (3 мкМ) приводило к снижению силы сокращения до 81 ± 3% (п = 11,р < 0.05) к 25—30 мин аппликации (рис. 2), что, по-видимому, связано с уменьшением концентрации сЛМР в кардиомиоцитах. На фоне действия бло-катора аденилатциклазы эффект Н28 был выражен в меньшей степени, чем в контроле, и составил 87 ± 2% (п = 13, р < 0.05) (рис. 2).
Для увеличения концентрации сЛМР использовали проникающие через мембрану аналоги — 8Вг-сЛМР и рСРТ-сЛМР в концентрации 100 мкМ. Аппликация 8Вг-сЛМР или рСРТ-сЛМР не вызывала статистически значимых изменений амплитуды сокращения. К 20 мин действия рСРТ-сЛМР сила сокращения полоски миокарда составила 110 ± 11% (п = 5, р > 0.05), а 8Вг-сЛМР -101 ± 5% (п = 5, р > 0.05) по отношению к контрольным значениям. Добавление №Н8 на фоне 8Вг-сЛМР снижала сократимость полоски до 70 ±6% (п = 5,р < 0.05) и до 57 ± 11% (п = 5,р < 0.05) в случае рСРТ-сЛМР
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.