ВОПРОСЫ ИХТИОЛОГИИ, 2015, том 55, № 5, с. 586-597
УДК 597.554.3.577.122.08
СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА КАПИЛЛЯРНОЙ ФИЛЬТРАЦИИ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ У ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ КРАСНОПЁРОК РОДА TRIBOLODON (CYPRINIDAE) © 2015 г. А. М. Андреева, Н. Е. Ламаш*, **, М. В. Серебрякова***, И. П. Рябцева
Институт биологии внутренних вод РАН, Борок *Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток **Дальневосточный федеральный университет, Владивосток ***НИИфизико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва E-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 11.07.2015 г.
Выявлен широкий диапазон осмотического градиента, создаваемого белками плазмы и тканевой жидкости, относительно стенки капилляра у краснопёрок рода Tribolodon в течение годового цикла. Максимальные значения градиента приближаются к таковым у млекопитающих. Распределение белка плазмы между внутри- и внесосудистой жидкостями организма зависит от приуроченного к сезону периода годового цикла (нерест, завершение нагула) и барьерных свойств капиллярной стенки (брюшины, мозга, белых мышц). Среди значений коэффициента осмотического отражения, характеризующего барьерные свойства стенки капилляра, не найдено соответствующих её абсолютной непроницаемости. Данную стратегию можно объяснить необходимостью выдерживания рыбами колебаний объёма внутрисосудистой жидкости и его быстрого восстановления после гиповолемии, а также особенностями белкового обмена рыб.
Ключевые слова: краснопёрки рода Tribolodon, капиллярная фильтрация белков плазмы, коэффициент осмотического отражения, коэффициент распределения.
DOI: 10.7868/S004287521505001X
Интерес к капиллярной фильтрации белков плазмы (КФБ) обусловлен, прежде всего, её ключевой ролью в процессах фильтрации внеклеточной жидкости организма, лежащих в основе го-меостаза всех его функций. Согласно базовой концепции капиллярного обмена Старлинга (Starling, 1896), фильтрация внутрисосудистой жидкости происходит под действием гидростатического давления, которому противодействует онкотическое давление плазмы. Последнее создаётся белками, насасывающими воду из межклеточного пространства. Концепция исходила из невозможности фильтрации белка плазмы в тканевое пространство. Позднее существование КФБ было доказано с помощью электронной микроскопии (Чернух и др., 1975; Schatzki, News-ome, 1975; Sharov, 1981; Shaklai, Tavassoli, 1982; Dvorak et al., 1996; Ueda et al., 2001; Максименко, Турашев, 2014). Теория "малых" и "больших" пор объяснила КФБ диффузией белков через поры различной "архитектуры" в стенке капилляра (Sarin, 2010). Фильтрационные свойства капиллярной стенки связывают с наличием на её эндо-телиальной поверхности комплекса мембрано-связанных молекул — гликокаликса (Michel, 1997; Weinbaum, 1998; Максименко, Турашев, 2014).
В применении к рыбам концепция КФБ нуждается в осторожной трактовке ввиду их особенностей как низших и пойкилотермных позвоночных. Одной из таких особенностей является наличие в тканевых жидкостях рыб значительных (сопоставимых по концентрации с плазмой крови) количеств белка (Hargens et al., 1974; Phillips, 2003). Причинами этого могут быть высокая проницаемость стенки капилляра (Kiernan, Contestable, 1980; Olson, 1992), несовершенство лимфатической системы (Olson et al., 2003) и невысокая скорость кровообращения у рыб. Наличие белка в тканевой жидкости определяет невысокие величины градиента его концентрации относительно стенки капилляра. Поскольку этот градиент противодействует создаваемому работой сердца гидростатическому давлению крови, регулируя тем самым баланс жидкости в организме, то вклад белков плазмы в процессы фильтрации оценивают у рыб как незначительный (Olson et al., 2003). Имеющиеся в литературе сведения о содержании белка в биологических жидкостях рыб зачастую носят противоречивый характер (Omura et al., 1985; Steffensen, Lomholt, 1992; Bushnell et al., 1998; Phillips, 2003; Jeong et al., 2008). На наш взгляд, данное обстоятельство обусловлено пой-
килотермной природой рыб и требует систематизации имеющихся сведений, а также установления закономерностей динамики содержания белка в жидкостях организма и его КФБ в ходе сезонных и репродуктивных ритмов в годовом цикле рыб.
В нашей работе проведён поиск закономерностей сезонной динамики КФБ у единственных проходных представителей семейства Сурптёае — генеративно-пресноводных по происхождению дальневосточных краснопёрок рода ТпЪо1ойоп, являющихся одними из массовых видов ихтиофауны и важными объектами прибрежного рыболовства в Приморье и на Сахалине. Летом и осенью дальневосточные краснопёрки нагуливаются в море; с ноября по февраль—март зимуют в реке; после кратковременного (март—апрель) нагула в море возвращаются для нереста в реку (апрель— май); молодь скатывается в море в первое же лето (Свиридов, 2002).
Цель работы — исследование белкового состава внеклеточных жидкостей организма и анализ сезонной динамики капиллярной фильтрации белков плазмы у крупночешуйной Т. hakonensis и мелкочешуйной Т. ЪгапйШ краснопёрок.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Особей крупно- и мелкочешуйной краснопёрок отлавливали в зал. Восток Японского моря и в устьях рек Раздольная и Волчанка в апреле 2012 г., в октябре 2008 и 2013 гг. Сроки отлова учитывали растянутый период единовременного нереста с первым его пиком в апреле и завершение нагульного периода в октябре (Гавренков, 1998). Видовую принадлежность рыб определяли по морфологическим и анатомическим признакам (Свиридов, 2002). Стадию зрелости гонад определяли по используемой в ихтиологической и рыбоводной практике шкале (Сакун, Буцкая, 1968). Всего было отловлено 63 рыбы.
Апрельская речная выборка Т. hakonensis включала 9 экз., в том числе 8 экз., принимающих участие в нересте текущего года (гонады III, IV, V и VI стадий зрелости), и одну неполовозрелую особь (II стадия); морская выборка — 8 экз. с гонадами III, IV и VI стадий зрелости. Апрельские речная и морская выборки Т. ЪгаЫШ были представлены соответственно 1 (IV стадия зрелости) и 5 (III, IV стадии зрелости) экз. Кроме того, в весенней речной выборке присутствовали 6 юве-нильных краснопёрок (неопределённой видовой принадлежности).
Октябрьская речная выборка Т. hakonensis включала 6 экз. с гонадами I стадии зрелости, морская выборка — 2 экз. со слаборазвитыми гонадами; речная выборка Т. Ът^Ш — 7 экз. с гонадами I стадии зрелости, морская — 5 экз. с резор-
бированными гонадами и 7 экз. с гонадами II стадии зрелости.
Кровь отбирали из хвостовых сосудов рыб. Для получения сыворотки (СК) кровь отстаивали при 4°С. Для получения плазмы (ПК) кровь собирали в пробирки с 1%-ным гепариноидом, осевшие эритроциты удаляли центрифугированием при 2000 об/мин. В сравнительном анализе динамики содержания общего белка использовали СК ввиду отсутствия в ней посторонних соединений; для анализа белкового состава биологических жидкостей использовали СК и ПК.
Гемоглобин использовали для проверки чистоты отбора образцов тканевой жидкости. Кровь собирали в пробирки с 1%-ным гепариноидом. Эритроциты осаждали центрифугированием при 2000 об/мин. Эритроцитарную массу промывали физиологическим раствором и центрифугировали, повторяя процедуру 3—5 раз. Далее эритроциты гемолизировали в дистиллированной воде, центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин; гемоглобин оставался в надосадочной жидкости.
В качестве аналогов интерстициальной жидкости в работе использовали тканевые жидкости (ТЖ) организма, не содержащие гемоглобин: мозговую (МЖ), жидкости из брюшины (БЖ) и белых мышц (БМЖ). Проверку проб на чистоту проводили в диск-электрофорезе, сравнивая электрофореграммы ТЖ и очищенного гемоглобина.
МЖ получали, вскрывая мозговую коробку рыбы в месте соединения средней обонятельной и лобных костей с помощью ножниц с тонкими длинными лезвиями. Через образовавшееся отверстие в месте выхода обонятельных нервов вводили капилляр (диаметр 0.5 мм) в область переднего мозга и отбирали жидкость. БМЖ отбирали выше боковой линии между краем жаберной крышки и спинным плавником. С помощью ножниц с длинными лезвиями делали кожный разрез и микронаконечником дозатора оттягивали кожу в глубине "кармана" так, чтобы создать в нём разрежение. Благодаря подсасывающему эффекту этого разрежения несколько микролитров мышечной жидкости собиралось в кармане, её отбирали для анализа. БЖ отбирали в местах её скопления после вскрытия брюшины. Перед электрофорезом образцы ТЖ центрифугировали 3 мин при 2000 об/мин.
Коэффициент распределения белка (г) характеризует распределение белка относительно стенки капилляра. Рассчитывали его без учёта содержания в ТЖ специфичных белков: г = Стж/Сск, где Стж и Сск — концентрации белка в ТЖ и СК. При расчёте коэффициента распределения белка плазмы для МЖ учитывали содержание в ней нейроспецифичных белков эпендиминов: г' =
588
АНДРЕЕВА и др.
= (Смж - Сэвд)/Сск, где Смж и Сэвд - концентрация белка и эпендимина в МЖ.
Коэффициент отражения белка (а) характеризует свойство проницаемости стенки капилляра (эндотелия) к белкам плазмы. Коэффициент отражения а рассчитывали, исходя из уравнения Мишеля и Филлипс Дя = аяС или а = Дя/яС (Michel, Phillips, 1987), выведенного из уравнения Старлинга (Neal et al., 2004), где Дя — разность он-котических давлений яС (в просвете капилляра) и П (в ткани). Параметры онкотического давления (я) в уравнении Мишеля и Филлипс мы заменили на соответствующие концентрации белка (С), учитывая линейную связь я и С (Чернух и др., 1975). После этого используемая нами в расчётах коэффициента отражения итоговая формула выглядела как: а = ДС/Сск, где ДС — разность концентраций белка в сыворотке крови (Сск) и тканевой жидкости (Стж).
При расчёте коэффициентов r, r' и а мы использовали значения концентраций белка не в ПК, а в СК — более удобной для работы жидкости, не содержащей посторонних соединений. При этом в обороте "капиллярная фильтрация белка плазмы" термин "плазма" не заменяли на термин "сыворотка" ввиду того, что все ТЖ содержали полный набор белков плазмы, включая фибриноген, который легко идентифицируется в геле 2D-SDS-E во фракции у-глобулинов (Gaal et al., 1980) по специф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.