БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 3, с. 412 - 426
УДК 577.353.2;591.543.42
СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА ГИГАНТСКИХ БЕЛКОВ ТОЛСТЫХ И ТОНКИХ НИТЕЙ И СТЕПЕНИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТАЙТИНА (КОННЕКТИНА) В ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТЫХ МЫШЦАХ МЕДВЕДЕЙ (Ursidae, Mammalia)
© 2015 Н.Н. Салмов1, И.М. Вихлянцев1*, А.Д. Уланова12, Ю.В. Грицына1, А.Г. Бобылев1, А.П. Савельев3, В.В. Макарющенко3, Г.Ю. Максудов4, З.А. Подлубная1,2
1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290 Пущино Московской области, ул. Институтская, 3; факс: +7(4967)33-0553, электронная почта: vikhlyantsev@iteb.ru
2Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290Пущино Московской области, пр. Науки, 3; факс: +7(4967)73-2711
3 Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. профессора Б.М. Житкова, 610000Киров, ул. Преображенская, 79; факс: +7(8332)38-1130
4Московский зоопарк, 123242 Москва, ул. Б. Грузинская, 1; факс: +7(495)605-1717
Поступила в редакцию 25.09.14 После доработки 01.12.14
Исследованы сезонные изменения изоформного состава белков толстых и тонких нитей (тайтина, тяжелых цепей миозина (ТЦМ), небулина), а также уровня фосфорилирования тайтина в поперечно-полосатых мышцах бурого медведя (Ursus arctos) и гибернирующего гималайского медведя (Ursus thibetanus ussuricus). Обнаружено снижение в 2,1—3,4 раза содержания Т2-фрагментов тайтина при отсутствии изменений в содержании небулина и изоформ интактного тайтина-1 (Т1) в скелетных мышцах (m. gastrocnemius, m. longis-simus dorsi, m. biceps) медведей во время зимнего сна. В левом желудочке сердца гибернирующих медведей обнаружено увеличение содержания более жесткой №В-изоформы тайтина по отношению к содержанию его более эластичной №ВА-изоформы. В миокарде бурого медведя в период зимнего сна наблюдалось уменьшение в ~1,6 раза содержания Т2-фрагментов при отсутствии снижения общего содержания изоформ Т1. Обнаружено незначительное увеличение уровня фосфорилирования тайтина в сердечной мышце гиберни-рующего бурого медведя. В скелетных мышцах бурого медведя не выявлено сезонных различий уровня фос-форилирования тайтина. Однако в них обнаружены изменения изоформного состава ТЦМ, направленные на увеличение доли медленной (I) и уменьшение доли быстрой (IIa) изоформ этого белка в период зимнего сна. Содержание изоформ ТЦМ I и IIa в скелетных мышцах гибернирующего гималайского медведя соответствовало таковому в скелетных мышцах гибернирующего бурого медведя.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: зимний сон, бурый медведь, гималайский медведь, поперечно-полосатые мышцы, толстые (миозиновые) нити, тонкие (актиновые) нити, тайтин, небулин, изоформы тяжелых цепей миозина, Pro-Q Diamond.
Зимняя спячка (гибернация) — эволюцион-но закрепленная способность некоторых млекопитающих к временному снижению метаболиз-
Принятые сокращения: АТРаза — аденозинтрифос-фатаза, ЛЖ — левый желудочек сердца, ТЦМ — тяжелые цепи миозина, Т2 — протеолитический фрагмент интактного тайтина-1 (Т1), ЧСС — частота сердечных сокращений, ПААГ — полиакриламидный гель.
* Адресат для корреспонденции.
ма с целью выживания в условиях низких температур и малодоступности пищи [1]. Некоторые виды семейства Медвежьих (Цгаёае), обитающие в областях с суровыми зимами, проводят самую холодную часть года, погрузившись в глубокий зимний сон в берлоге. В отличие от истинных гибернантов (сусликов, сурков, хомяков, ежей), температура тела которых во время оцепенения может снижаться до 0° и ниже [1—3], температура тела у медведей в период
зимнего сна снижается лишь на 5—7°, и они легко переходят в активное состояние. Однако скорость метаболических процессов во время зимнего сна у них снижается в несколько раз [4], и изменения обмена веществ сходны с таковыми у истинных гибернантов. Во время зимнего сна, который может длиться до 5—7 мес., медведи не едят и не пьют, а также не совершают акты дефекации и мочеиспускания [5]. Одной из интересных физиологических особенностей медведей, пребывающих в состоянии зимнего сна, является отсутствие выраженных атрофических изменений в скелетных мышцах и значительного снижения их максимальной силы после пробуждения животного [6—9]. Уникальной пластичностью обладает сердечная мышца медведей. В частности, длительный период сниженной активности миокарда в период зимнего сна (например, у гризли (Ursus arctos horribilis) частота сердечных сокращений (ЧСС) снижается с 84 до 19 уд/мин) не приводит к развитию сердечной недостаточности или дилатации камер сердца [10, 11]. Механизмы, ответственные за поддержание мышечной массы медведей во время зимнего сна, а также уникальную пластичность их сердечной мышцы в этот период, до конца не ясны.
В данной работе проведено исследование сезонных изменений изоформного состава белков толстых (тайтин, тяжелые цепи миозина) и тонких (небулин) нитей, а также уровня фосфори-лирования тайтина в поперечно-полосатых мышцах бурого медведя (Ursus arctos) с целью выявления роли этих изменений в адаптации мышц к условиям зимнего сна. Аналогичные исследования проведены на поперечно-полосатых мышцах самца гималайского медведя (Ursus thibetanus ussuricus), находящегося в состоянии зимнего сна.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы поперечно-полосатые мышцы следующих медведей: 1) миокард левого желудочка сердца и скелетные мышцы (m. longissimus dorsi, m. biceps) взрослого самца гималайского медведя, добытого на берлоге 28 января 2013 г. в Облученском районе Еврейской автономной области в верховьях реки Дитур, 90 км западнее г. Биробиджан; 2) миокард левого желудочка сердца и скелетные мышцы (m. longissimus dorsi, m. gastrocnemius) взрослой самки бурого медведя, добытой 24 марта 2013 г. на берлоге в Юкаменском районе Удмуртской республики; 3) миокард левого желудочка сердца и m. gastrocnemius 6-летней самки бурого медведя, пребывавшей в активном состо-
янии и вынужденно застреленной 20 апреля 2013 г. на биостанции ВНИИОЗ, г. Киров; 4) миокард левого желудочка сердца и скелетные мышцы (m. gastrocnemius, m. longissimus dorsi) взрослого самца активного бурого медведя, добытого 9 сентября 2013 г. в окрестностях д. Катни в Котельническом районе Кировской области. Все животные были добыты легально на основании специальных разрешений, выданных региональными Управлениями по охране и использованию объектов животного мира.
Для электрофоретического разделения изо-форм интактного тайтина-1 (N2B, N2BA, N2A, NT) и небулина использовали крупнопористый 2,1-2,2%-ный ПААГ в присутствии Ds-Na с содержанием агарозы 0,5—0,6%, приготовленный по методу Татсуми—Хаттори [12] с нашими модификациями [13]. Подготовку электрофорети-ческих проб проводили по методу, исключающему их нагревание выше 40° [14], с целью предотвращения разрушения тайтина под действием более высоких температур. Для электрофоре-тического разделения изоформ тяжелых цепей миозина (ТЦМ) использовали 7%-ный ПААГ в присутствии Ds-Na, приготовленный по методу Тикунова с соавт. [15]. Электрофорез проводили в аппаратах с вертикальным расположением геля (ООО «Хеликон», Россия), размер пластинки геля 8 х 10 см, толщина геля 1 мм. Гели, окрашенные Coomassie Brilliant Blue G-250 и R-250, смешанными в пропорции 1 : 1, сканировали, а затем проводили денситометрическую обработку сканов с помощью компьютерной программы Total Lab v1.11. Содержание тайтина и небу-лина оценивали по отношению к содержанию тяжелых цепей миозина (крупнопористые гели, укрепленные агарозой). Содержание изоформ ТЦМ (7%-ный ПААГ) оценивали в процентах от общего содержания миозина.
Уровень фосфорилирования тайтина оценивали с помощью флуоресцентного красителя на фосфатные группы белков Pro-Q Diamond («Invitrogen», США) по методу Борбели с соавт. [16] c незначительными модификациями. После проведения электрофореза гель фиксировали в течение 12—18 ч в растворе, содержавшем 50%-ный этанол и 10%-ную уксусную кислоту. После 30 мин отмывки в дистиллированной воде гель окрашивали в течение 1,5 ч красителем на фосфатные группы. Окрашенный гель отмывали в готовом растворе (Pro-Q(R) Diamond Phospho-protein Gel Destaining Solution, «Invitrogen», США) в течение 1,5 ч. Полосы тайтина, содержавшие фосфатные группы, визуализировали с помощью системы гель-документирования и оценки содержания фосфатных групп в белках (Pharos FX Plus Molecular Image, «Bio-Rad», США). После
этого гели окрашивали Coomassie Brilliant Blue G-250 и R-250, смешанными в пропорции 1 : 1, для контрольной оценки содержания белка.
Для выяснения функциональной роли фос-форилирования тайтина было проведено выделение этого белка из сердечной мышцы бурых медведей с последующим измерением его влияния на актин-активируемую АТРазную активность миозина кролика in vitro. Выделение тай-тина проводили по методу, описанному в работе Сотериоу с соавт. [17]. Тайтин очищали на колонке размером 1,0 х 60,0 см с Sepharose CL-2B («Sigma», США). Чистоту выделенных препаратов тайтина тестировали с помощью электрофореза в крупнопористом ПААГ, укрепленном ага-розой, в присутствии Ds-Na. Выделение актина и миозина из мышц кролика и изучение влияния тайтина на актин-активируемую АТРазную активность миозина in vitro проводили по описанным ранее методам [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Сезонные изменения изоформного состава тайтина и небулина в скелетных мышцах медведей.
Тайтин (титин/коннектин, 2000—3700 кДа) и не-булин (600—900 кДа) — гигантские белки сарко-мерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных [19]. Тайтин — белок толстых (миозиновых) нитей. Его молекулы длиной более 1 мкм перекрывают половину саркомера от М-линии до Z-диска, формируя третью фила-ментную систему в миофибриллах. В А-зоне сар-комера тайтин связан с миозиновыми нитями (эта часть молекулы получила название Т2). В I-зоне саркомера некоторые участки молекулы тайтина взаимодействуют с тонкими (актиновыми) нитями, однако большая часть его молекулы в этой зоне проходит свободно, формируя эластичное соединение между концами миозиновых нитей и Z-диском (для ссылок см. обзор Вихлянцева и Подлубной [20]). На каждую миозинов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.