БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.6, c.1037-1041
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.21
ШПИЛЕЧНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ КАК ПЕРЕНО СЧИКИ
АКТИНОМИЦИНОВ
© 2009 г. Н.Л. Векшин, И.В. Савинцев
Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области E-mail: nvekshin@rambler.ru Поступила в p едакцию 27.03.06 г. После доработки 26.12.07 г.
Обнаружено и изучено перераспределение актиномицинов от олигонуклеотидной шпильки HP1 к растворенной и клеточной ДНК. Установлено, что проникновение антибиотика в комплексе с HP1 в опухолевые клетки происходит более эффективно и ведет к усиленной гибели этих клеток. П редполагается использовать подобные шпильки в качестве переносчиков, облегчающих доставку гетероциклических антибиотиков к опухолевым клеткам.
Ключевые слова: актиномицин, ДНК, олигонуклеотид, опухолевые клетки, флуоресценция.
Актиномицины являются эффективными антибактериальными и противоопухолевыми лекарствами [1,2]. Типичный их представитель актиномицин D (AMD) со стоит из феноксазо-нового хромофора и двух пептидо-лактонных колец [1]. Биологическая активность этого антибиотика обусловлена его встраиванием в ДНК, ведущим к ингибир ованию РНК-полиме-разной реакции, синтеза белка и клеточного деления [1]. Поскольку AMD плохо проникает в клетки сквозь цитоплазматическую мембрану, пр и этом сильно налипая на поверхность клеток, то возникает проблема его доставки к клеточной ДНК.
Известно, что AMD и его флуоресцирующий аналог 7-аминоактиномицин D (7AAMD) могут с высоким сродством (> 106 M-1) связываться с синтетическими шпилечными олиго-нуклеотидами [3,4] например, со шпилькой HP1 d(5'-AAAAAAATAGTTTTAAATATTTTTTT-3') [5,6]. В случае 7AAMD это пр иводит к усилению флуор есценции. Наибольшее различие в интенсивности флуоресценции свободного и связанного 7AAMD наблюдается при возбуждении на «красном» краю спектра поглощения и детекции в «синей» области спектра излучения [7].
Целью данной работы является изучение возможности использования шпилек типа HP1 в качестве молекулярных переносчиков гетероциклических антибиотиков, в частности акти-номицинов, к растворенной ДНК и к ядерной
Сокращения: AMD - актиномицин D, 7AAMD - 7-ами-ноактиномицин D.
ДНК опухолевых клеток (асцитная карцинома Эр лиха).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы: актиномицин D, 7-аминоактиномицин D (Fluka), шпилька HP1 d(5'-AAAAAAATAGTTTTAAATATTTTTTT-3') (Midland Certified Reagent Сотрапу, США) и ДНК из фага лямбда (АДНК).
Кинетику связывания актиномицинов с HP1 в миллисекундном диапазоне регистрировали на флуоресцентной установке stopped-flow (Applied Photophysics, Великобритания) пр и возбуждении 550 нм и эмиссии > 570 нм. Кинетические кривые аппроксимировали по методу Гаусса-Ньютона в трехэкспоненциальном пр и-ближении с помощью пакета Matlab 4.0 (MathWorks, 1пс.).
Медленное перераспределение 7AAMD с HP1 на ДНК в минутном диапазоне регистр и-ровали на спектр офлуориметре Perkin-Elmer MPF при возбуждении 570 нм и эмиссии при 610 нм в односантиметровых кварцевых кюветах пр и 20°С спустя 6 с после смешивания ра створ а комплекса 7АAMD/HP1 с избытком ДНК.
Цитотоксическое воздействие НР1-актино-мициновых комплексов изучали на клетках ас-цитной карциномы Эрлиха. Клетки карциномы выделяли из брюшной полости мышей и хранили в питательной ср еде RPMI (pH 7,5). Клеточную суспензию разбавляли до 0,5 миллионов клеток в 1 мл. Комплекс AMD/HP 1 или 7AAMD/HP1 в мольном соотношении 1:1 (в
Таблица 1. Интенсивность флуоресценции 7AAMD в HP1 и разных ДНК
Pаcтвоp Интенсивность, отн.ед.
HP1 + 7AAMD 2610
HP1 + 7AAMD + 10 м^ AMD 160
Лосо севая ДНК + 7AAMD 740
Тимусная ДНК + 7AAMD 560
А ДНК + 7AAMD 505
А ДНК + 7AAMD + 80 м^ AMD 205
Буфер + 7AAMD 130
Примечание. Концентрация 7AAMD - 1 мкМ. Буфер -20 мМ трис-HCl (рН 7,5). Концентрация ДНК и HP1 -0,014 мг/мл. Возбуждение - 570 нм, эмиссия - 610 нм.
водном растворе) добавляли при перемешивании в клеточную среду до конечной концентр ации 10 мкМ. Клетки инкубировали в такой среде в течение суток при 37°С. Смертность клеток определяли на микр оскопе ЛЮМАМ в проходящем свете при прокрашивании трепа-новым синим (10 мкМ). П рокр ашивание антибиотиком ядерных структур клеток и анализ локализации 7AAMD в клетках проводили на ЛЮМАМ при 900-кратном увеличении; флуоресценцию регистрировали в диапазоне 600-700 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе [4] наблюдались две компоненты кинетики диссоциации 7AAMD из олигонукле-отидов под действием детергента додецилсуль-фата натрия. Диссоциация 7AAMD из олиго-нуклеотидов происходила быстро, а диссоциация из комплекса с ДНК - медленно [8]. В наших опытах время формирования комплекса между 7AAMD и НР1 при 26°С со ставляло 0,3 с. Медленная компонента отсутствовала.
Оказалось, что AMD и 7AAMD конкурируют за место связывания внутри шпильки HP1. Причем процесс замещения происходит за доли секунды. Чтобы изучить конкуренцию между 7AAMD и AMD за динамическую «полость» внутри шпильки, к комплексу 7AAMD/HP1 был добавлен избыток AMD. Добавление AMD приводило к мгновенному падению флуоресценции 7AAMD (табл. 1), поскольку 7AAMD способен за 0,3 с замениться в шпильке на AMD (табл. 2). Это время совпадает с временем связывания 7AAMD. Значит, пр и замене 7AAMD в шпильке на AMD (и наоборот) энергетический барьер невысок. Сходная, но гораздо менее выраженная, конкуренция между
Таблица 2. Быстрая и медленная компоненты связывания 7AAMD и AMD с HP1 и А ДНК
Комплекс t\, с t2, с a2/a1
7AAMD + HP1 0,29 - -
7AAMD/HP1 + AMD 0,31 - -
7AAMD + А ДНК 4,6 40 0,3
7AAMD/HP1 + А ДНК 4,5 101 1,7
7AAMD/HP1 + ШС1 + А ДНК 4,9 147 3,5
П римечание. Концентрация 7AAMD - 1 мкM, HP1 - 2,4 мШ (0,021 мг/мл), АДНК - 0,014 мг/мл, Nad - 50 мМ. Буфер - 20 мМ трис-Ha с 1 мМ ЭДТА fcH 7,5). Возбуждение 570 нм, эмиссия 610 нм. В ряде опытов stc^ ped-flow концентрация 7AAMD была 2 мкM, HP1 - 10 мкM, AMD - 10 мкM; возбуждение - 550 нм, эмиссия > 570 нм.
7AAMD и AMD наблюдалась при их связывании с ДНК (табл. 1). В отличие от HP1, где есть лишь одно место связывания, в ДНК имеется много таких мест. Хромофор ы 7AAMD и AMD при комплексообразовании находятся в молекуле ДНК или HP1 в гидрофобном окружении, сходном по физико-химическим свойствам с окружением 7ААМД в пир идине [7]. П р и-чем, встраивание актиномицинов происходит преимущественно не на поверхности, а в динамической «полости» между двумя цепочками нуклеотидов, но без стэкинга с ними [6]. Вероятно, именно поэтому актиномицины не являются канцерогенами (в отличие от этидий-бромида, интеркалирующего между основаниями ДНК по стэкинговому типу [9]).
Кинетика встраивания 7AAMD или AMD в ДНК имеет бифазный характер: наблюдаются быстрая и медленная компоненты [10]; в наших условиях - 4,6 и 40 с (табл. 2). Быстрая компонента имеет в три раза большую амплитуду, чем медленная (a2/a1 = 0,3). Быстрая компонента соответствует связыванию 7AAMD внутри расплетенных мест или петель, а медленная -встраиванию 7AAMD в двойную спираль или (и) связыванию 7AAMD с медленно возникающими динамически расплетенными участками, которые появляются в ДНК благодаря конфор-мационным флуктуациям. Как известно, ДНК в водном растворе не является классической двойной спиралью: пр ямолинейные участки не превышают 800 A даже при высокой ионной силе раствора. П ри низкой ионной силе ДНК сильно «разрыхляется», прямолинейные участки уко рачиваются до 500 A [11]. P а сплетенные участки и петли существенно отличны от же-
ШПИЛЕЧНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ КАК ПЕPЕНОCЧИКИ АКТИНОМИЦИНОВ 1039
сткой двойной спирали. Такие не-уотсон-кри-ковские структуры всегда имеются в раствор енной ДНК, о собенно пр и низкой ионной силе. Они сходны с синтетическими шпильками по высокому сродству к актиномицинам. Однако длительно сть быстр ой компоненты в случае ДНК оказалась во много раз больше, чем в случае HP1 (табл. 2). Это, по-видимому, обусловлено тем, что петли и слегка подраспле-тенные уча стки ДНК имеют все-таки до статоч-но компактную и относительно жесткую струк -тур у, а шпилька HP1 - гибкая, «р ы хлая», со свободными концами. Некотор ая доля молекул 7AAMD может в случае ДНК сорбироваться снаружи, например, в малой бороздке, но квантовый выход излучения 7AAMD оттуда почти столь же низок, сколь из водной фазы, и поэтому не вносит существенного вклада в сигнал.
Флуор есценция 7AAMD возр а стает пр и связывании с HP1 гор аздо сильнее, чем пр и связывании с разными видами нативной ДНК (табл. 1). Тушение нуклеотидами флуоресценции 7ААМD в ДНК происходит намного эффективнее, чем в HP1 [12]. Это позволяет наблюдать процесс перераспределения 7AAMD из комплекса с H P1 на ДНК после добавления избытка ДНК к комплексу 7AAMD/HP 1 (рис. 1). Отметим попутно, что в работе [13] была пр едположена возможно сть медленного пер е-распределения молекул актиномицина внутри макромолекулы ДНК - от одних мест связывания к другим. Медленное пер ер аспр еделение 7AAM D с HP1 на ДНК в наших опытах наблюдалось после смешивания раствора комплекса 7А AMD/HP1 с избытком ДНК. П р оцесс такого «пер еползания» со стоит из быстр ой фа -зы - 4,5 с (она детектир овалась на 8!орре<1-:£Ь^ флуор иметр е) и медленной фазы - 101 с; соотношение амплитуд a2/a1 = 1,7 (табл. 2), т.е. амплитуда медленной компоненты заметно выше. Чем больше добавляли ДНК, тем быстр ей шел пр оцесс. Две компоненты соответствуют двум типам участков ДНК. Пер вый тип - это петли и р а сплетенные уча стки, а втор ой - на-тивная двойная спир аль и медленно возникающие динамические р асплетения. Увеличение ионной силы (50 мМ NaCl) приводило к 1,8-кратному снижению амплитуды быстр ой компоненты , в то вр емя как амплитуда медленной компоненты изменялась мало. Ионная сила контр олирует скор о сть пер ер аспр еделения 7AAMD от HP1 к ДНК благодаря тому, что при высокой ионной силе ДНК имеет менее «р ы хлую» стр ук -
тур у.
Pезультаты наших опытов in vitro позволили предположить, что актиномицины in vivo могут легко перераспределяться к ДНК опухолевых
Рис. 1. Перенос 7ААМБ из комплекса с НР1 на ЯДНК; 1 - интенсивность флуо р есценции 7ААМБ в комплексе с НР1, без ЯДНК; 2 - то же после добавления ЯДН
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.