ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 472-477
УДК 579.841.1:(543.553+543.95):543.395
ШТАММ Comamonas testosteroni TI КАК ПОТЕНЦИАЛЬНАЯ ОСНОВА КЛЕТОЧНОГО СЕНСОРА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
© 2004 г. Л. А. Таранова**, А. П. Фесай**, Г. В. Иващенко**, А. Н. Решетилов*,
М. Винтер-Нильсен***, Д. Эмнеус****
* Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, 142292;
e-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru ** Институт биоколлоидной химии им. Ф.Д. Овчаренко НАН Украины, г. Киев, 252680 *** Институт водных экосистем, Хорсхолм, Дания **** Лундский Университет, Лунд, Швеция Поступила в редакцию 9.10.2003 г.
Исследована модель клеточного биосенсора на основе штамма Comamonas testosteroni TI, деструктора неионогенного поверхностно-активного вещества (НПАВ) - нонилфенолэтоксилата (ОП-10). Нижний предел обнаружения для биосенсора по отношению к НПАВ составил 0.25 мг/л. Исследована субстратная специфичность биосенсора по отношению к широкому спектру органических соединений - поверхностно-активных веществ (ПАВ), полиароматических углеводородов (ПАУ), углеводов, спиртов и других соединений. Показано, что биосенсор на основе штамма Comamonas testosteroni TI характеризовался отсутствием сигнала на глюкозу, что является преимуществом по сравнению с ранее описанным биосенсором на основе штамма Pseudomonas rathonis T. Величина сигнала сенсора оставалась стабильной на протяжении 10 сут.
Разработка биосенсорных систем для определения токсичных химических соединений относится к актуальным задачам. Перспективным направлением обнаружения ксенобиотиков является создание мультисенсорных систем на основе бактерий-деструкторов. В широком спектре ксенобиотиков одно из первых мест по масштабам промышленного производства приходится на долю ПАВ. Хотя эти соединения малотоксичны, они тем не менее представляют опасность ввиду способности повышать концентрацию различных поллютантов в водной фазе за счет их солюбилиза-ции. Среди них наибольшей устойчивостью в окружающей среде характеризуются вещества, в состав молекулы которых входит ароматическое кольцо, в частности неионогенные ПАВ (НПАВ) [1]. Несмотря на необходимость высокоточного контроля за их содержанием в окружающей среде, до сих пор не создано достаточно эффективного экспресс-метода их определения. Вместе с тем интенсивно развиваемое в течение двух последних десятилетий направление аналитической биотехнологии - биосенсоры - дает возможность создания чувствительных, дешевых и простых в обращении анализаторов. В приложении к природоохранным задачам перспективными считаются микробные биосенсоры, основанные на использовании клеток микроорганизмов, несущих плазмиды биодеградации соответствующих соединений, и характеризующиеся простотой использования и низкой стоимо-
стью анализа. Описано большое количество лабораторных моделей микробных биосенсоров природоохранного назначения, способных определять нафталин [2], дихлорметан, катехол, фенол, хлор-фенолы [3], аммиак, азот, нитраты, сульфиды и ПАВ [4, 5], а также оценивать биологическое потребление кислорода (ВПК) и общую токсичность [6, 7]. Модель сенсора, представленная в работе [4], была успешно использована для анализа линейных алкилсульфонатов в водах реки Аяза в Японии. В работе [3] также представлена модель микробного сенсора, позволяющего производить определение ПАВ в различных средах. Кроме того, характеристики ряда биосенсоров для анализа ПАВ были описаны нами в работах [8, 9-11].
Известны микроорганизмы-деструкторы ПАВ, характеризующиеся узкой субстратной специфичностью [11], что открывает перспективу для их использования в качестве основы микробных биосенсоров для анализа ПАВ. Особенно привлекательной является возможность создания мультисенсорных систем, что может существенно расширить спектр обнаруживаемых соединений. При конструировании подобных систем необходимо иметь набор штаммов-деструкторов, обладающих различной субстратной специфичностью.
Цель работы - характеристика модели микробного биосенсора на основе штамма-деструктора НПАВ Comamonas testosteroni Т1.
МЕТОДИКА
Культивирование микроорганизмов. Использовали штамм-деструктор нонилфенолэтоксилата C. testosteroni TI, выделенный нами ранее из почвы, загрязненной ПАВ и способный разрушать ОП-10 в концентрациях от 100 до 300 мг/л. Культивирование проводили на качалке (140 об/мин) при 28°C в колбах Эйленмейера, содержащих жидкую синтетическую среду следующего состава (г/л): Na2HPO4 - 1.0, NH4NO3 - 1.0, KCl - 0.5, MgCl2 -0.01, 0П-10-0.2. Биомассу собирали центрифугированием (5000 g, 20 мин), трижды отмывали 30 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 7.8.
Субстраты. В качестве исследуемых субстратов были использованы различные ксенобиотики.
1. Поверхностно-активные вещества, содержание основного вещества, % (ОВ-%). Неионо-генные: 0П-10 (ОВ-99), твин 80 (ОВ-98), тритон Х-100 (ОВ-98), тритон Х-350 (ОВ-98), додециловый эфир полиэтиленгликоля, n = 10 и n = 14 (ОВ-90), цетиловый эфир полиэтиленгликоля, n = 6 (ОВ-90), диэтаноламид (ОВ-90), сульфоэтоксилат (ОВ-90). Анионные (АПАВ): додецилсульфат натрия (ДДС-Na, ОВ-100), волгонат (ОВ-60), метаупон (ОВ-37), алкилнафталинсульфонат (АНС, ОВ-50), динатриевая соль моноалкилсульфоянтарной кислоты (ДНС, ОВ-39), препараты алкилбензолсуль-фоната (АБС): АБС линейный (ОВ-90), АБС разветвленный (ОВ-80), АБС разветвленный (произведен в Сумгаите, РФ, ОВ-40), хлорный суль-фанол (ОВ-50). Катионные (КПАВ): алкоксиметил-диэтиламмоний-метилсульфат (алкамон, ОВ-100), этоний (ОВ-100), цетилпиридиний-хлорид (ОВ-100), тетрадецилтриметиламмоний-бромид (ОВ-100), алкилдиметилбензоламмоний-хлорид (катамин, ОВ-100), имидостат (ОВ-100). Амфолитные (АмПАВ): алкиламино-бис-пропионат (ОВ-85), амидобетаин (ОВ-50).
2. Ароматические и полициклические соединения: фенантрен, антрацен, нафталин, флуорен, пирен, аценафтен, аценафтилен, салицилат, 3-ме-тасалицилат, 5-метасалицилат.
3. Углеводы: глюкоза, арабит, арабиноза, ксилит, ксилоза, галактоза, сорбит, сорбоза, сахароза, фруктоза, мальтоза, рафиноза.
4. Спирты: метанол, этанол, пропанол, бута-нол, глицерин.
5. Соединения других классов: мочевина, хлороформ, диметилформамид, бисакриламид, акри-ламид, нонилфенол.
Биосенсорный анализ. Рецепторный элемент формировали включением клеток C. testosteroni TI в 2%-ный агаровый гель по методике, описанной в работах [9, 10]. Полученный рецепторный элемент (мембрану) толщиной 0.3-0.5 мм помещали на измерительную поверхность электрода Кларка и фиксировали с помощью капроновой сетки.
нА/с 0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
10
100 мг/л
Рис. 1. Чувствительность сенсора (нА/с) на основе С. testosteroni Т1 к неионогенным ПАВ (мг/л). Приведены средние значения 10 измерений для каждой концентрации соединения. 1 - тритон Х-100, 2 - ОП-10, 3 - твин-80.
В качестве преобразователя биосенсора использовалась амперометрическая система 1п§оМ 5313/010 (США). Измерения проводили в кювете объемом 5 мл при постоянном перемешивании и 20°С в диапазоне полного насыщения по кислороду. Измеряемым параметром (сигналом сенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстрата (нА/с).
Операционная стабильность (время работы одного рецепторного элемента) определялась многократным измерением 0П-10 в концентрации 100 мг/л на протяжении 20 сут, при этом рецепторный элемент находился в буферном растворе при постоянном перемешивании и комнатной температуре.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Чувствительность биосенсора. Биосенсор на основе клеток С. testosteroni Т1 характеризовался высокой чувствительностью к ряду НПАВ (рис. 1). Нижняя граница определения 0П-10 составляла 0.25 мг/л, тритона Х-100 - 0.5 мг/л, твин-80 -0.25 мг/л. Верхняя граница определения совпадала с критической концентрацией мицеллообразования и составляла для различных НПАВ 60-150 мг/л.
Специфичность детекции. При измерении субстратной специфичности полученные данные относили к величине ответа на 0П-10 (принятой за 100%), что облегчало сравнение ответа сенсора на различные субстраты. Измерения проводили при концентрации ксенобиотиков в растворе 100, 5 и 1 мг/л. Показания сенсора при тестируемой концентрации 5 и 1 мг/л в большинстве случаев
1
Таблица 1. Субстратная специфичность микробного сенсора на основе штамма С. testosteroni Т1
Субстрат, 100 мг/л 0твет сенсора,* % от ответа на 0П-10 Субстрат, 100 мг/л 0твет сенсора,* % от ответа на 0П-10
ДДС-Ка 105 Сульфоэтоксилат 45
Волгонат 88 Этоний 47
Метаупон 57 Амидобетаин 40
АНС 5 Катамин 0
ДНС 127 Алкамон 0
АБС нп-3 88 Имидостат 0
АБС линейный 94 Глюкоза 0
АБС разветвлен. 35 Арабит 0
АБС сум. разветв. 0 Арабиноза 0
Твин-80 90 Ксилит 0
Твин-20 132 Ксилоза 0
Тритон Х-100 95 Галактоза 0
Тритон Х-350 52 Сорбит 0
Додециловый эфир полиэтиленгликоля, п = 10 90 Цетилпиридиний-хлорид 35
Додециловый эфир полиэтиленгликоля, п = 6 81 Тетрадецилтримети-ламмоний-бромид 0
Цетиловый эфир полиэтиленгликоля, п = 6 52 Алкиламино-бис-пропионат 13
Диэтаноламид 83 Сорбоза 0
Сахароза 22 Раффиноза 0
Фруктоза 13 Метанол 0
Мальтоза 0 Этанол 84
Пропанол 54 Бисакриламид 0
Бутанол 0 Акриламид 0
Глицерин 0 Хлороформ 0
Мочевина 0 Нонилфенол 0
Диметилформамид 0 НП-40 48
* Ответ сенсора на 100 мг/л ОП-10 составлял 0.023 нА/с.
совпадали, в связи с этим приводятся результаты значений только для концентрации 1 мг/л.
Данные табл. 1 и 2 демонстрируют величины сигналов сенсора на различные соединения в концентрации 100 и 1 мг/л соответственно. Характерно, что при тестируемой концентрации АПАВ, равной 100 мг/л, наблюдался разброс сигналов в отношении различных АПАВ в диапазоне 80-100% от ответа на 0П-10, а при концентрации 1 мг/л относительная чувствительность снижалась до 20-40% от ответа на 0П-10 (табл. 2). Так, при исследовании субстратной специфичности по отношению к АПАВ в концентрации 100 мг/л были получены высокие величины сигнала на ДДС-Ка (105% от ответа на 0П-10), а также на ДНС (127% от ответа на 0П-10), в то время как показания
сенсора при вводе АНС составляли только 5% от ответа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.