ОНТОГЕНЕЗ, 2008, том 39, № 3, с. 198-207
ЦИТОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ РАЗВИТИЯ
УДК 57.034:577.217.5+57.085.23
СИГНАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ САМООРГАНИЗАЦИИ РИТМА СИНТЕЗА БЕЛКА В КУЛЬТУРАХ ГЕПАТОЦИТОВ - ГАНГЛИОЗИДЫ И КАТЕХОЛАМИНЫ - ФУНКЦИОНИРУЮТ НЕЗАВИСИМО
ДРУГ ОТ ДРУГА1
© 2008 г. Н. Д. Звездина, Л. А. Мальченко, В. И. Фатеева, В. Я. Бродский
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова 119334 Москва, ул. Вавилова, д.2б E-mail: brodsky.idb@bk.ru Поступила в редакцию 16.07.07 г.
Окончательный вариант получен 28.09.07 г.
Учитывая данные о снижении уровня самоорганизации (самосинхронизации) ритма синтеза белка при старении, изучено возможное влияние сигнальных факторов самоорганизации - ганглиозидов и катехоламинов - друг на друга, а также исследованы особенности рецепции катехоламинов. Объект исследования - первичные культуры крысиных гепатоцитов на стеклах. Торможение синтеза ганглиозидов не препятствовало действию а-адреномимитика фенилэфрина в организации ритма синтеза белка. После блокады а-рецепторов празозином ритм синтеза белка наблюдали после действия ганглиозидов. а-Адренолитики празозин и беноксатиан прекращали синхронизирующий эффект фенилэфрина. Р-Адренолитик пропранолол ликвидировал синхронизирующее действие Р-ад-реномиметика изопротеренола. Смесь а- и Р-адренолитиков ингибирует организующее ритм синтеза белка действие норадреналина. Таким образом, сигнальные молекулы самоорганизации ритма синтеза белка функционируют независимо друг от друга, действуя через специфические рецепторы.
Ключевые слова: межклеточные взаимодействия, межклеточная кооперация, самоорганизация клеток, самоорганизация ритма синтеза белка, гепатоциты, ганглиозиды, норадреналин, фенилэф-рин,изопротеренол,адренолитики.
Ранее было показано, что прямые межклеточные взаимодействия приводят к синхронизации колебаний скорости синтеза белка в культурах гепатоцитов, и в результате определяется суммарный ритм в популяции клеток (Бродский и др., 1997, 2005, 2006а,б; Бго<^ку й а1., 2000, 2003, 2007; Звездина и др., 2003). Эндогенными сигнальными факторами - триггером цепи реакций, организующих ритм, - являются ганглиозиды вМ1 или вБ1а, синтезирующиеся в гепатоцитах и выделяющиеся в межклеточную среду. В иммуноцитохимическом исследовании мы обнаружили высокую экспрессию вМ1 в культурах с выраженным ритмом синтеза белка. Блокирование синтеза и выделения ганглиозидов ликвидировало ритм. Другими сигнальными факторами, также организующими ритм, в наших опытах были адреномиметики нор-адреналин и его фармакологический аналог фени-лэфрин. Синтезируется ли в гепатоцитах норадреналин, неизвестно и сомнительно: блокирование
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 06-04-48109, 05-04-48293).
синтеза и секреции ганглиозидов, как отмечалось, ликвидировало ритм, чего не было бы, если в клетке и в кондиционированной среде был бы норадреналин. Экзогенный, добавленный в среду фениэф-рин, как известно, воспринимается а-адренорецеп-торами, а норадреналин - и а-, и Р-рецепторами. Обе ли группы рецепторов активны при введении в среду норадреналина? Только ли через рецепторы действует на клеточные культуры норадреналин? Как основание декарбоксилированный фе-нилаланин - норадреналин, изменяя свойства межклеточной среды, заведомо может влиять на синтез белка. Влияют ли ганглиозиды и катехола-мины друг на друга в рецепции синхронизирующего гепатоциты сигнала? Ганглиозиды, как известно, могут быть корецепторами многих лигандов.
Задачи этой работы могут быть интересны в выяснении влияний старения на ритм синтеза белка. У старых крыс ритм выражен слабо (Бродский и др., 2005). В сыворотке крови, межклеточной среде гепатоцитов in situ, значительно снижена концентрация ганглиозидов и норадреналина (Прозоровская, 1983; Nakamura et al., 1993; Ozkok et al., 1999). По на-
шим данным, добавление ганглиозидов в сыворотку повышало синхронизацию ритма синтеза белка до уровня, характерного для гепатоцитов молодых животных.
Как и ранее (Brodsky et al., 2000), в работе использованы два типа первичных культур крысиных гепатоцитов на стеклах. В плотных культурах с близко расположенными клетками ритм синтеза белка выявляется практически сразу же после смены среды, т.е. такие культуры быстро самосинхронизируются. В разреженных культурах, полученных из той же суспензии изолированных гепатоцитов примерно в 10-кратном разведении, ритм определяется лишь через несколько часов культивирования. Именно в исходно несинхронных культурах введение в среду ганглиозидов или катехола-минов выявляет ритм уже через 10-15 мин, т.е. сигнальные факторы быстро организуют клетки.
Гипотезы о влиянии различных синхронизаторов синтеза белка друг на друга и возможном неспецифическом их действии не подтвердились. В настоящей работе показано, что ганглиозиды и ка-техоламины синхронизируют ритм синтеза белка независимо друг от друга. Катехоламины осуществляют свою организующую функцию, связываясь со специфическими а- и Р-адренорецептора-ми гепатоцитов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Исследована кинетика синтеза белка в культурах гепатоцитов, изолированных из печени крыс линии Вистар (вес 250-280 г, возраст около 3 мес). Методы подготовки и изучения материала подробно изложены ранее (Brodsky et al., 2000; Бродский и др., 20066). Для изоляции клеток использовали раствор коллагеназы в бескальциевой среде; в суспензии содержалось не менее 90% жизнеспособных гепатоцитов. Исходную или разведенную суспензию разливали в чашки Петри со стеклами, покрытыми коллагеном. Получали или плотные культуры с близко расположенными клетками, или же разреженные культуры. Культуры содержали в среде 199 с 0.2 мг/мл альбумина для клеточных культур ("Sigma", США) и 0.5 мкг/мл инсулина ("Sigma", США) в газовой фазе: 95% воздуха и 5% С02. В большинстве опытов использовали суточные культуры; в одной серии - двухсуточные.
Пробы, по три культуры каждая, брали последовательно через 10 мин в течение 2 ч. Каждую культуру инкубировали отдельно в течение 10 мин при 37°C в среде с 3Н-лейцином (92.5-111 х 104 Бк/мл, специфическая молярная активность 259-370 х х 10-6 Бк/ммоль). Культуры промывали холодной средой и обрабатывали холодной (4°С) 5%-ной
хлорной кислотой в течение 90 мин. Затем культуры промывали этиловым спиртом, и клеточные белки растворяли гиамином (бензетониум гидрок-сид, "Sigma"). Радиоактивность лейцина в белках и небелковой кислоторастворимой фракции, т.е. свободного лейцина в клетках, измеряли в каждой культуре, используя сцинтилляционный счетчик LKB 1214 Rackbeta (Швеция). Рассчитывали относительное включение лейцина в белки с поправкой на пул свободного лейцина (формулу для расчетов см. в цитированных выше статьях). Поскольку включение и пул измеряли в одной и той же культуре, в относительной величине Icorr вводится поправка не только на варьирование пула, но также на число клеток в культуре. Каждый опыт ставили на культурах гепатоцитов одной крысы. Индивидуальные различия абсолютных значений интенсивности синтеза белка у разных крыс для целей нашей работы несущественны: мы сравнивали кинетику синтеза белка в клетках одной и той же печени.
Изучена кинетика синтеза белка при действии на культуры гепатоцитов адреномиметиков - но-радреналина, фенилэфрина и изопротеринола, а также влияние адренолитиков - беноксатиана, празозина и пропранолола; все реактивы - фирмы "Sigma", США.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Показана синхронизация колебаний скорости синтеза белка фенилэфрином после торможения секреции и синтеза ганглиозидов в культурах гепатоцитов (рис. 1). Специфический ингибитор РРРР (1- фенил -2-гексадеканоламино-3-пирролидино-1-пропанол гидрохлорид) тормозит активность глю-козилцерамидсинтазы, ключевого фермента синтеза ганглиозидов (Li, Ladisch, 1996, 1997; Olshefski, Ladisch, 1998; Wen Deng et al., 2000). По нашим данным (Brodsky et al., 2003), после обработки гепатоцитов РРРР более чем на 90% снижается концентрация ганглиозида - синхронизатора GM1 в межклеточной среде. Как было показано и ранее, в новом опыте (рис. 1) РРРР ликвидировал ритм синтеза белка в плотных культурах гепатоцитов. В контрольных плотных культурах после смены среды, как обычно, регистрировали околочасовой ритм синтеза белка с 50- и 20-минутными периодами в этом 2-часовом опыте. агАдреномиметик фенилэфрин в дозе 2 мкМ, введенный на 2 мин в среду с культурами, предобработанными РРРР, восстанавливал ритм синтеза белка: в течение 2 ч наблюдали 40, 20 и 30-минутные периоды. Следовательно, ингибирование синтеза ганглиозидов не сказывается на рецепторах фенилэфрина и, соответственно, на сигнальной синхронизирующей
1550
950
350
1550 Ь
Рис. 1. Исследование самосинхронизации ритма синтеза белка в 2-суточных плотных культурах гепатоцитов: а - контроль: плотные культуры инкубированы в течение 2 сут в нормальной среде, отмыты, инкубированы 10 мин в свежей среде, отмыты, инкубированы еще 60 мин с последующим взятием из той же среды проб с 3Н-лейцином; б - эффект а1-адреноблокатора беноксатиана (0.35 мкМ ) на 2-суточные культуры: плотные культуры инкубированы в течение 2 сут в нормальной среде, отмыты, инкубированы 10 мин в свежей среде, инкубированы 60 мин в среде с беноксатиа-ном с последующим взятием проб из той же среды; в - культуры предынкубированы с 1мкМ РРРР, отмыты, инкубированы 10 мин в нормальной среде, вновь отмыты, перенесены в свежую среду и через 60 мин взяты пробы из этой среды; г - фенилэфрин после предынкубации культур с РРРР: инкубация 24 ч с РРРР, отмывка, инкубация 10 мин в среде, куда на 2 мин (от 8 до 10 мин) внесен ферилэфрин до финальной концентрации 2 мкМ, отмывка, инкубация 60 мин в нормальной среде с последующим взятием из той же среды проб с 3Н-лейцином. Здесь и далее: по оси абсцисс - время, мин; по оси ординат - 1С0ГГ, имп/мин.
функции этого адреномиметика. На рис. 1, б приведены данные о сохранении ритма синтеза белка в плотных культурах после их обработки в течение 1 ч агадренолитиком беноксатианом (0.35 мкМ). Поскольку эндогенным синхронизатором в культивируемых гепатоцитах, вероятно, являются только ганг
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.