МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 4, с. 684-691
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 576.315:577.217.39
СИГНАЛЫ ЯДЕРНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ В БОЛЬШОЙ СУБЪЕДИНИЦЕ ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 3 - БЕЛКЕ р170
© 2004 г. Е. М. Чудинова, П. А. Иванов1, Е. С. Надеждина*
Институт белка Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290 Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 Поступила в редакцию 19.12.2003 г.
Эукариотические трансляционные факторы или их отдельные субъединицы могут иметь самостоятельные функции в клетках, в том числе регулировать процессы, происходящие в ядре. При анализе первичной структуры большой субъединицы фактора инициации eIF3 человека, р170, обнаружены четыре потенциальных сигнала ядерной локализации (NLS) и изучена их функциональность, т.е. способность направлять р170 в ядро. кДНК фрагментов р170, слитых с зеленым флуоресцентным белком, экспрессировали в культивируемых клетках CV-1 и Cos-1 обезьяны. Локализацию продуктов экспрессии изучали с помощью флуоресцентной микроскопии. Оказалось, что как минимум два из четырех потенциальных двухчастных NLS, содержащихся в р170, действительно направляют фрагменты р170 в клеточное ядро. При этом более крупные фрагменты р170, имеющие те же NLS, удерживаются в цитоплазме. Предполагается, что с помощью каких-то специфических факторов или после ограниченного протеолиза р170 поступает в клеточное ядро, где может принимать участие в регуляции экспрессии генома. Не исключена также возможность регуляции функционирования р170 в цитоплазме через обратимое связывание импортинов с его NLS.
Ключевые слова: фактор инициации трансляции 3, eIF3a, субъединица р170, человек, кДНК, сигнал ядерной локализации, культивируемые клетки, трансфекция, зеленый флуоресцентный белок.
LARGE SUBUNIT OF TRANSLATION INITIATION FACTOR - 3 p170 CONTAINS POTENTIALLY FUNCTIONAL NUCLEAR LOCALIZATION SIGNALS, by E. M. Chudinova, P. A. Ivanov1, E. S. Nadezh-dina (Institute of Protein Research of Russain Academy of Science, Pushchino, 142290 Moscow region, Russia; 1A.N. Belozersky Institute for Physico-Chemical Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, 119992 Moscow, Russia; *e-mail: enadezhdina@genebee.msu.ru). Eukaryotic translation factors and their subunits can have independent cellular functions, including regulation of nuclear events. We analyzed primary structure of p170 large subunit of human translation initiation factor eIF3 and found four potential bipartite nuclear localization signals (NLS). Then we studied whether these NLS were functional, that is were able to direct protein to cell nucleus. Complementary DNA of p170 fragments were expressed in cultured CV-1 and Cos-1 green monkey cells, and localization of fused with GFP proteins was determined by fluorescent microscopy. We established that p170 molecule possessed at least two functional NLS which determined nuclear localization of p170 fragments. At the same time more long p170 fragments containing the same functional NLS could be retained in cytoplasm. We speculate that either using specific factors or after limited proteolysis p170 can enter cell nucleus and participate in genome expression regulation. Also we do not exclude the possibility that functioning of p170 in cytoplasm can be regulated by reversible binding of importins to its NLS.
Фактор инициации трансляции е1Р3 млекопитающих состоит из 11-12 кодируемых самостоятельными генами белковых субъединиц [1, 2]. В процессе инициации трансляции е1Р3 связывается с 408 рибосомной субъединицей, препятствует преждевременному, до формирования 43Б ини-циаторного комплекса, связыванию 60Б субъединицы [3], стабилизирует присоединение тройного комплекса, состоящего из е1Б2, вТР и Ме1-тРНК [4], и способствует связыванию мРНК [5]. По-видимому, е1Р3 служит структурным "каркасом", с
* Эл. почта: enadezhdina@genebee.msu.ru
которым связываются другие участники инициации трансляции. Тем не менее, структурная сложность eIF3 кажется избыточной для выполнения его непосредственных функций.
Некоторые из субъединиц eIF3 могут существовать в клетке как самостоятельные белки, функция которых не имеет прямого отношения к трансляции. Так, субъединица р48 eIF3 была описана ранее как белок Ш6, повышенная концентрация укороченной формы которого характерна для раковых клеток [6]. 1Шб/р48 принимает участие в регуляции протеасомной деградации бел-
ков, в частности, митотических циклинов [7]. Интересно, что при экспериментально вызванной в клетках гиперпродукции Int6/p48 поступает в ядра, где связывается с белком Rfp [8].
В раковых клетках также бывает повышена концентрация большой субъединицы eIF3 р170 [9-11]. До 20% клеточного пула р170 в этих клетках, по-видимому, не ассоциировано с eIF3 [11]. Содержание р170 в препаратах eIF3, выделенных из разных источников, может отличаться очень значительно [12, 13]. Практически полное отсутствие р170 не влияет на активность фактора eIF3 в инициации трансляции, измеряемой по связыванию AUG-кодона [12]. р170 взаимодействует с несколькими другими субъединицами eIF3 и с рРНК [14]. Возможно, функция р170 заключается в модуляции активности трансляции избранных матриц. В частности, экспериментально показано, что недостаток в клетках р170 ингибирует синтез белка микротрубочек тубулина, а избыток - стимулирует, не влияя на синтез ряда других белков [15].
В клетках мышиной асцитной карциномы Эр-лиха синтезируются белки центросомин А и цен-тросомин В, гомологичные центральной части р170 и, возможно, являющиеся продуктами альтернативного сплайсинга мРНК р170 [16-18]. Белок центросомин В локализуется в ядре. Центросомин А при низких уровнях экспрессии его кДНК в клетках связывается с центросомой, а при более высоких уровнях экспрессии также накапливается в ядре [1б]. Однако иммунофлуорес-центное окрашивание клеток антителами к р170 обычно обнаруживает его в цитоплазме [18, 19], и лишь некоторые антитела выявляют небольшое количество этого белка и в ядре [20]. Можно предположить, что молекула р170 содержит участки, направляющие его в ядро, т.е. сигналы ядерной локализации (NLS), которые обычно неактивны и активируются при изменении профиля трансляции.
В настоящей работе предпринят компьютерный поиск NLS в молекуле р170 и проведена проверка функциональной активности этих NLS с использованием синтеза в культивируемых клетках млекопитающих отдельных фрагментов р170, трансляционно слитых с зеленым флуоресцентным белком из Aequorea victoria (GFP), и изучена локализация этих фрагментов.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Анализ аминокислотных последовательностей проводили с помощью пакетов программ, расположенных на веб-сайте Expasy (http://cn.ex-pasy.org). Использовали программы PROSITE, COILS, ProtScale, REP и другие.
Клонирование фрагментов и полноразмерной кДНК р170. Фрагменты кДНК большой субъединицы eIF3 белка р170 (Accession number EMBL-DataBank U58046) синтезировали с помощью ПЦР с праймерами производства "Синтол" (Россия). Границы фрагментов и структура прайме-ров указаны в табл. 1. Для получения кДНК N-концевого фрагмента р170К в качестве ПЦР-ма-трицы использовали клонотеку кДНК культивируемых клеток HeLa ("Stratagene", США); для получения центрального и С-концевого фрагментов р170М и р170С - кДНК полноразмерного р170 (KIAA0139) в векторе НА 04032, любезно предоставленную Kazusa DNA Research Institute (Япония). Короткий C-концевой фрагмент р170Сс получен ранее [19]. Синтезированную кДНК клонировали с помощью рестриктаз производства "MBI Fermentas" (Литва) в векторы pGEX-4T2 или pGEX-4T3 ("Amersham Biosciences", Великобритания) и pEGFP-C1 или pEGFP^2 ("BD Biosciences Clontech", США). Порядок клонирования и использованные рестриктазы указаны в табл. 1. р170Сс-фрагмент переклонировали из вектора pUC18 в вектор pEGFP-d. Плазмидную ДНК для трансфекции культивируемых клеток наращивали в штамме Escherichia coli DH-5a и очищали с помощью набора Midiprep ("Gibco/BRL", США).
Трансфекция культивируемых клеток, микроскопическое исследование и анализ белков. Фиб-робластоподобные клетки CV-1 и Cos-1 зеленой мартышки культивировали в среде, состоящей из 45% DMEM, 45% F10, 10% сыворотки крови новорожденных телят ("Биолот", Россия). В среды для культивирования добавляли гентамицин (0.1 мг/мл). Клетки выращивали при 37°С в присутствии 5% С02. За день до эксперимента клетки рассаживали на покровные стекла в чашках Петри. Трансфек-цию клеток проводили с помощью липосомного реагента Unifectin для клеток CV-1 или Maxifectin-56 для клеток Cos-1, согласно приложенному протоколу. Липосомные реагенты любезно предоставлены А. Суровым. Через 24 ч клетки фиксировали 3%-ным формальдегидом для флуоресцентной микроскопии или получали гомогенат клеток для проведения иммуноблотинга.
Препараты фиксированных клеток просматривали в микроскопе Axiophot ("Zeiss", ФРГ), фотографировали цифровой видеокамерой MicroMax ("Princeton Instruments", США). Использовали объективы Planapo х63 и х40. Измеряли интенсивность флуоресценции на компьютерных изображениях клеток, используя программу Im-ageJ. Соотношение содержания синтезированных
Таблица 1. Фрагменты р170, использованные в работе, и их клонирование
ON 00 ON
Фраг- Границы фрагмента Праймеры для ПЦР Промежуточное клонирование, рестриктазы Клонирование в вектор для трансфекции Расчетная мол. масса слитого белка, кДа
мент нуклео-тиды** аминокислотные остатки прямой обратный рестриктазы вектор
pl70N 97-1653 1-519 CCTGGATCCAAGAT GCCGGCCTATTTTC CGTGTCGACATCTG CTCTGAAGGCATGC TTGC Sacl, Sail Bgll, Sail pEGFP-Cl 87
Р170М 1638-2520 514-808 CCGAGCTCCATGCC TTCAGAGCAGT GGAGTCGACCTCTA TAGTATGTAATCCT GCGTT Sac I, Sail Sacl, Sail pEGFP-C2 62
р170С 2500-4241 802-1382 GGTGGATCCGAAC GCAGGATTACATAC TATAGAG GGAGTCGCACGTC GTACTGT GGTCCATCC BamHl, Sail Bglll, Sail pEGFP-Cl 93
Р170Сс 3654-4241 1156-1382 GCACGAGCTCGTTT CTCGGTACCTTAAC Sac I, Sacl, pEGFP-Cl 54
CCCAGACGGGGTG GTCGTACTGTGGTC С GGAGTCGCACGTC GTACTGT GGTCCATCC Kp
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.