БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 10, с. 1371 - 1376
УДК 577.352.3
ШЛИБИН УМЕНЬШАЕТ ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ МЕМБРАНЫ ГЕПАТОЦИТОВ КРЫСЫ, ИНДУЦИРОВАННОЕ ЦИКЛОСПОРИНОМ А
© 2006 г. В. Моулисова1*, М. Србова2, О. Едличкова1, Ж. Шебастиан1, А. Егоров3
1 Department of Plant Physiology, Faculty of Biological Sciences, University of South Bohemia, Branisovska 31, 370 05 Ceske Budejovice, Czech Republic; fax: +420 385 310366, E-mail: vladimira.moulisova@email.cz
2 Department of the Medical Chemistry and Biochemistry, The 2nd Medical Faculty, Charles University, Plzenska 221, 150 06 Praha 5, Czech Republic; fax: +420 224 435 820, E-mail: martina.srbova@lfmotol.cuni.cz
3 IVAXPharmaceuticals s. r. o., Research Unit, Branisovska 31, 370 05 Ceske Budejovice, Czech Republic; fax: +420 385 310 331, E-mail: Alexandr_Jegorov@ivax-cz.com
Поступила в редакцию 26.02.06 После доработки 17.05.06
Изучалось влияние циклоспорина А на перекисное окисление липидов в изолированных гепатоцитах крысы. После инкубации образцов в присутствии циклоспорина А наблюдалось значительное увеличение концентрации маркера перекисного окисления липидов (липофуксинподобного пигмента) по сравнению с контрольными образцами. При добавлении гепатопротектора флавоноида силубина продуцирование липофуксинподобного пигмента заметно снижалось. Полученные результаты указывают на потенциальную позитивную роль силубина в ослаблении эффекта циклоспорина А, связанного с образованием активных форм кислорода и повреждении плазматической мембраны
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: циклоспорин А, силубин, гепатоциты, перекисное окисление липидов, липофук-синподобные пигменты.
Циклоспорин А (С85А) — потенциальный им-муносупрессор. Он широко применяется при трансплантациях [1] и лечении некоторых аутоиммунных заболеваний [2]. Однако применение С8Л связано со многими побочными эффектами, такими как его нефро- и гепатотоксичность. Установлено, что некоторые из этих эффектов связаны с окислительным стрессом, индуцируемым С8Л. Получены данные об участии С8Л в образовании активных форм кислорода (АФК), что связано с его метаболизмом, в который вовлечены цитохром Р450 [3], а также МЛБРН-ок-сидаза [4] и ксантиноксидаза [5]. Показано, что С8Л влияет на уровень экспрессии ферментов-антиоксидантов. Он способствует снижению активности каталазы и глутатионпероксидазы [6]. Кроме того была описана активная форма другого циклоспорина — гидропероксид циклоспорина Б [7]. Следовательно, не исключена возможность трансформации С8Л в перекисное соеди-
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
нение, которое способно вызывать окислительное повреждения клетки.
Липофуксинподобные пигменты (ЬБР) образуются в качестве конечного продукта пере-кисного окисления липидов [8]. Эти пигменты участвуют в патогенезе различных заболеваний, таких как атеросклероз и сахарный диабет, а также в процессах старения. Благодаря своей способности к флуоресценции, они используются как маркеры негативных процессов в клетках [9]. Предшественники этих молекул — альдегиды, точнее малондиальдегиды, которые используются так же, как маркеры перекисного окисления липидов [10, 11].
Несмотря на то что точное строение молекул этих пигментов до сих пор неизвестно, показано, что определение их относительных концентраций с помощью иммунохимических методов или с использованием флуориметра является достаточно точным и надежным методом определения степени окислительных повреждений липидной составляющей клеточных мембран.
Основным достоинством этого метода является стабильность LFP: они не подвергаются дальнейшим химическим преобразованиям и накапливаются в клетке в течение ее жизни.
Силимарин — смесь гепатопротекторных флавоноидов, содержащихся в молоке расто-ропши пятнистой (Silybum marianum). Силибин — основной компонент силимарина (рис. 1). Он используется либо сам по себе, либо в составе смеси с другими флавоноидами. Силимарино-вый комплекс защищает клетки печени как благодаря своим антиоксидантным свойствам, так и благодаря способности стабилизировать клеточную мембрану [14]. Этот комплекс используется при лечении различных заболеваний печени [15]. Силимарин способен уничтожать свободные радикалы [16] и защищать клетки от повреждений, возникших в результате перекис-ного окисления липидов при интоксикации, вызванной тетрахлорметаном, этанолом или парацетамолом [17—19]. Силимарин ингибирует активность некоторых ключевых ферментов, катализирующих образование свободных радикалов и активных форм кислорода: активность ксантиноксидазы падает в присутствии силима-рина [20], блокируется также активность цитохро-ма Р450 [21, 22].
Нами была выдвинута гипотеза о том, что способность силибина защищать клетки от окислительного стресса связана с CsA в клетках печени. Целью настоящей работы было детектирование маркеров перекисного окиления, образующихся в результате инкубации изолированных гепатоцитов крысы с CsA и определение способности силибина уменьшить концентрацию этих маркеров.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Химические реактивы. Реактивы были получены от фирмы «Penta» (Чехия), Hepes, бычий альбумин и сыворотка теленка были предоставлены «MP Biomedicals, Inc», EGTA, диметил-сульфоксид (DMSO), Вильямс медиум Е и три-пановый голубой — фирмой «Sigma Chemicals Co» (Чехия). Коллагеназа была получена от фирмы «Sevapharma» (Чехия). Циклоспорин А и силибин были предоставлены «IVAX Pharmaceuticals» (Чехия), кетамин (Narkamon®) и ксилазин (Rometar®) — фирмой «Lcwa» (Чехия).
Экспериментальные животные. Взрослые самцы крыс линии Wistar/Han весом 150—200 г были предоставлены фирмой «BioTest s.r.o.» (Чехия). Животных содержали в стандартных лабораторных условиях (12-часовой дневной/ночной период) со свободным доступом к пище и
воде до начала экспериментов. Перед выделением клеток животных анестезировали с использованием кетамина (100 мг/кг веса животного) в сочетании с ксилазином (16 мг/кг тела животного). Все процедуры с животными проводили в соответствии с правилами, принятыми Комитетом этики Министерства образования Чешской Республики.
Первичные культуры гепатоцитов крыс. Гепа-тоциты крыс изолировали с использованием двухступенчатой коллагеназной перфузируемой печени крыс in vitro [23]. Клетки помещали в фосфатный буфер, фильтровали и промывали несколько раз с использованием низкоскоростного центрифугирования (50 g), затем промывали с использованием Вильямс медиум Е реактива с гидрокарбонатом Na (без L-глутамата и фенолового красного) [24]. Выделенные гепатоци-ты ресуспендировали в Вильямс медиум Е реактиве с добавлением 0,5% сыворотки теленка. Жизнеспособность клеток определяли, используя тест с трипановым голубым. Аккуратно ре-суспендированные клетки инкубировали в течение 1 ч в стерильных пробирках на воздухе при 6°. Жизнеспособность клеток равнялась примерно 85—95% во всех экспериментах. Эксперименты по окислению проводились после проведения контроля жизнеспособности клеток. Содержание белка определяли по методу Лоури [25].
Эксперименты по окислению. Инкубацию ге-патоцитов с тестируемыми веществами производили при 20°. Инкубационная смесь содержала в первом варианте 25 мкМ CsA, во втором — 25 мкМ CsA и 100 мкМ силибина (добавленных вместе). Третий вариант был контрольным. Конечная концентрация клеток равнялась 8 • 105 клеток/мл (3,3 мг белка/мл). Сыворотка теленка (0,5%) и 0,5% DMSO в качестве растворителей для исследуемых реагентов присутствовали во всех растворах для инкубации. Препараты отбирали после 0, 3, 6, 9, 12, 24 и 48 ч инкубации для каждого варианта, немедленно замораживали и хранили в жидком азоте до измерения концентрации LFP.
Рис. 1. Структура силибина
Измерение флуоресценции. Концентрацию LFP в гепатоцитах определяли согласно Гольд-штейну и МакДонаху [26] c модификациями, использовавшимися в предыдущих работах [27]. 500 мкл суспензии гепатоцитов добавляли к 5 мл смеси хлороформ—метанол (2 : 1) и экстрагировали в течение 1 ч на шейкере. После экстракции добавляли 2 мл дистиллированной воды и центрифугировали (2000 g, 10 мин). После центрифугирования отделяли нижнюю фазу, содержавшую хлороформ, и использовали ее для измерения флуоресценции с помощью спектро-флуориметра Bowman Series 2. Спектр возбуждения измеряли в диапазоне длин волн 250—400 нм, спектр эмиссии измеряли в диапазоне длин волн 300—500 с шагом в 10 нм. Для более детальной характеристики LFP производили измерение синхронного спектра с постоянной разностью в 10 нм между длинами волн возбуждения и эмиссии. Определение концентрации LFP базировалось на максимумах возбуждения и эмиссии полученных методом ЗБ-спектрально-го анализа. Флуориметр был откалиброван с применением стандарта № 5 фирмы-изготовителя. Концентрацию LFP выражали в относительных единицах флуоресценции (rfu) на мг белка.
Обработка результатов. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения флу-ориметра и SigmaPlоt. Эксперименты проводили в трех повторностях, результаты представляли как среднее значение ± среднеарифметическое отклонение.
Мы сравнили синхронные спектры образцов с С8Л, с С8Л и силибином и контрольные образцы. Согласно полученным нами данным, образование ЬБР (присутствие в спектрах пиков эмиссии с длиной волны 350 и 405 нм) происходит во всех образцах, как в присутствии силиби-на, так и без него, различие состоит только в концентрации ЬБР. Это доказывает, что даже добавление силибина не предотвращает полностью образование ЬБР. Данные, полученные при изучении синхронного спектра показывают отсутствие качественных изменений ЬБР (рис. 3, см. цветную вклейку), хотя ЬБР начали образовываться уже через 12 ч инкубации (рис. 4). Количественное измерение концентрации ЬБР в гепатоцитах крыс производили в течение 48 ч эксперимента. Содержание ЬБР, выраженное в относительных единицах флуоресценции (г£ц) определяли по высоте основного пика, при длинах волн возбуждения и эмиссии 352 и 430 нм соответственно. После добавления 25 мкМ С8Л в начале эксперимента концентрация ЬБР возрастала в течение 12 ч инкубации и достигала 4,43 ± 0,37 г£ц на 1 мг белка. Концентрация ЬБР в образцах после добавления 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.