ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 3, с. 311-317
УДК 579.25 579.262;579.64
СИМБИОЗ КОЗЛЯТНИКА ВОСТОЧНОГО С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ Rhizobium galegae: СПЕЦИФИЧНОСТЬ И КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТЬ
© 2007 г. Ал. X. Баймиев, И. И. Губайдуллин, Ан. X. Баймиев, А. В. Чемерис,
X. М. Баймиев, В. А. Вахитов
Институт биохимии и генетики УНЦ РАН Уфа, 450054; e-mail: alex@anrb.ru Поступила в редакцию 10.01.2006 г.
Исследованы конкурентоспособность и генетическая изменчивость штаммов Rhizobium galegae из коллекции ВНИИСХМ РАСХН, вызывающих нодуляцию козлятника восточного, в условиях почв Башкортостана, где изначально данный вид ризобий отсутствует. Обнаружено, что из использованных штаммов наиболее конкурентоспособными являются CIAM 0702 и CIAM 0704, имеющие по две, 1500 и 2000 МДа, мегаплазмиды. С применением метода случайной амплификации полиморфных последовательностей ДНК (random amplified polymorphic dNA - RAPD) показано, что штаммы R. galegae в ризосфере растения-хозяина способны интенсивно обмениваться генетическим материалом. Обнаружить местные клубеньковые бактерии, изначально способные инфицировать козлятник восточный или приспособившиеся к этому в результате различных генетических перестроек, не удалось.
Козлятник восточный (Galega orientalis) - перспективная кормовая культура, часто называемая "северной соей". Естественный ареал произрастания данного вида - Кавказ. В среднюю полосу России козлятник интродуцирован и в диком виде не произрастает. Данное обстоятельство является причиной отсутствия в почвах Башкортостана специализированных клубеньковых бактерий, способных полноценно инфицировать это бобовое растение. Таким образом, этот регион можно использовать в качестве модельного для изучения специфичности симбиоза и конкурентных отношений штаммов ризобий в системе козлятник -Rhizobium galegae.
Ризобиям R. galegae, вступающим в симбиоз с козлятником восточным, свойственна строгая специфичность по отношению к своему растению-хозяину. Более того, из данных литературы [1] известно, что козлятники восточный и лекарственный вступают в симбиоз с разными штаммами азотфиксирующих бактерий R. galegae. Причем штаммы, нодулирующие растения козлятника восточного, не способны инфицировать растения козлятника лекарственного и наоборот.
Такой строгий симбиоз, характерный для эво-люционно молодых бобовых подсемейства мотыльковых, произрастающих в умеренных широтах, является наиболее эффективным с точки зрения способности фиксировать азот атмосферы. Счита-
ется, что эволюция бобово-ризобиального симбиоза шла в направлении повышения специфичности взаимодействия партнеров, сопровождаемое увеличением азотфиксирующей активности [2].
Фиксация атмосферного азота бобовыми растениями в симбиозе с ризобиями является даром Природы, который человечество должно использовать с максимальной эффективностью. Для этого продолжается постоянный поиск новых высокоэффективных штаммов симбиотических ризобий, селекция известных, а также их модификация с помощью мутагенеза и рекомбинации.
Цель работы - исследование конкурентоспособности используемых в изготовлении промышленных препаратов ризоторфина штаммов ризобий в почве и специфичности их взаимодействия с растением-хозяином.
МЕТОДИКА
Штаммы ризобий. Для исследований конкурентоспособности взяты близкие по основным куль-турально-морфологическим признакам 8 штаммов Rhizobium galegae, полученные из Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (С.-Петербург) : aAM 0702, aAM 0703, aAM 0704, aAM 0708, aAM 0719, CIAM 0720 и CIAM 0721, вступающие в эффективный симбиоз с козлятником восточным (Оа1е-
Таблица 1. Штаммы Rhizobium galegae, использованные в работе и их краткое описание
Штамм Растение-хозяин Характеристика Место отбора
CIAM 0701 Galega orientalis nod+fx 1 плазмида: 1500 мДа ЧССР
Galega officinalis nodt+fix~
CIAM 0702 Galega orientalis 2 плазмиды: 1500 и 2000 мДа С.-Петербург
CIAM 0703 » 1 плазмида: 1500 мДа Эстония
CIAM 0704 » 2 плазмиды: 1500 и 2000 мДа С.-Петербург
CIAM 0708 » 1 плазмида: 1500 мДа Северная Осетия
CIAM 0719 » 1 плазмида: 1500 мДа Финляндия
CIAM 0720 » 1 плазмида: 1500 мДа Алтай
CIAM 0721 » 1 плазмида: 1500 мДа Алтай
Таблица 2. Процентные соотношения штаммов ризобий в клубеньках козлятника восточного на делянках 2 и 3 года культивирования
Штамм
Время культивирования
2 г.
3 г.
CIAM 0701 CIAM 0702 CIAM 0703 CIAM 0704
CIAM 0708
CIAM 0719
CIAM 0720
CIAM 0721
Смесь штаммов
Без инокуляции
40% С1АМ 0701, 60% С1АМ 0702
85% С1АМ 0702, 15% С1АМ 0703
15-20% С1АМ 0702, 60-70% С1АМ 0703 15-20% С1АМ 0704
10% С1АМ 0703, 80% С1АМ 0704 10% С1АМ 0708
15-20% С1АМ 0704, 65-75% С1АМ 0708 10-15% С1АМ 0719
10-15% С1АМ 0708, 70-75% С1АМ 0719 15% С1АМ 0720
10-15% С1АМ 0719, 65-75% С1АМ 0720 15-20% С1АМ 0721
10-15% С1АМ 0720, 60-70% С1АМ 0721 10-15% С1АМ 0702, 10% остальные штаммы
20% С1АМ 0702, 15% С1АМ 0704 65% остальные штаммы, 1-5% гибриды
25% С1АМ 0702, 20% С1АМ 0704 55% остальные штаммы
10-15% С1АМ 0701, 85-90% С1АМ 0702 1-2% С1АМ 0703
80-85% С1АМ 0702, 15-20% С1АМ 0703 1-5% гибриды
по 20-25% С1АМ 0702 и С1АМ 0704
50-60% С1АМ 0703, 1-2% С1АМ 0708, 1-5% гибриды
по 10-15% С1АМ 0703 и С1АМ 0708 70-80% С1АМ 0704, 1-5% гибриды по 1-2% С1АМ 0702 и С1АМ 0719
20% С1АМ 0704 65-70%, С1АМ 0708, 10-15% С1АМ 0719, 1-5% гибриды, по 1-2% С1АМ 0703 и С1АМ 0720
по 10-15% С1АМ 0708 и С1АМ 0720, 65-75% С1АМ 0719, 1-5% гибриды, по 1-2% С1АМ 0704 и С1АМ 0721
по 10-15% С1АМ 0719 и С1АМ 0721, 65-75% С1АМ 0720, 1-5% гибриды, 1-2% С1АМ 0708
5-10% С1АМ 0720, 45-60% С1АМ 0721 15-25% С1АМ 0702, 20% остальные штаммы
35-40% С1АМ 0702, 35-40% С1АМ 0704 10-20% остальные штаммы, 5-15% гибриды
40-45% С1АМ 0702, 35-40% С1АМ 0704 15-25% остальные штаммы, 1-5% гибриды
ga orientalis) и CIAM 0701, нодулирующий как растения козлятника восточного, так и лекарственного (Galega officinalis), но в обоих случаях не способный фиксировать азот. Краткая характеристика штаммов дана в табл. 1.
Подготовка опыта. Ризобии выращивали на среде TY (%): дрожжевой экстракт - 0.1, бакто-триптон - 1, CaCl2 - 0.1, агар - 1.5 в течение 2 сут при 28°С до оптической плотности D600 1.5. Семена козлятника восточного стерилизовали в концентрированной серной кислоте в течение 5 мин,
затем, тщательно промыв в стерильной воде, засыпали в колбу с соответствующим штаммом ризобий и смесь высевали на открытые делянки, расположенные на территории Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Размеры делянок составляли 1 х 2 м, расстояние между ними 20 см. Последовательность делянок представлена в табл. 2.
Идентификация клубенькообразующего штамма. Клубеньки многократно отмывали в водопроводной воде, затем стерилизовали их поверхность
последовательно 10 мин в 70%-ном этаноле и 10 мин в 10%-ном гипохлорите натрия. Затем многократно промывали стерильной водопроводной водой. Клубенек раздавливали и разрушали до гомогенного состояния пинцетом в микропробирке в 20 мкл среды TY с соблюдением условий стерильности. Затем суспензию центрифугировали при 3000 g 5-10 с и супернатант рассевали на чашки Петри с безазотной средой. Выросшие колонии пересевали на чашки Петри со средой TY и проверяли на принадлежность к ризобиям с помощью амплификации с праймерами, подобранными к nif-генам клубеньковых бактерий.
Электрофоретическое разделение мегаплаз-мид. Наличие плазмид определяли модифицированным методом Экхарта. Ночную культуру бактерий пересевали в новую колбу со средой TY до различимой глазом мутности и подращивали 2 ч при 28°С. Затем инкубировали при 4°С без перемешивания, отбирали 500 мкл и осаждали на центрифуге. Осадок мягко ресуспендировали в 30 мкл трис-боратного буфера, содержащего 20% сахарозы, лизоцим и РНКазу, и тут же наносили в лунки 0.7%-ного агарозного геля с 0.1% ДДС-Na. Через 10-15 мин осуществляли префорез при 0.5 V/см геля в течение 30 мин и далее осуществляли разделение ДНК при V/см в течение ночи при 4°С.
ПЦР и секвенирование ДНК. Бактериальную ДНК выделяли стандартным методом, используя перхлорат натрия и смесь фенола и хлороформа после обработки клеток лизоцимом и ЭДТА. Качество и количество выделенных препаратов ДНК определяли аналитическим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле при напряжении 6 V/см длины геля. Все вышеописанные процедуры проводили по стандартным прописям, изложенным в лабораторном руководстве [3].
Анализ RAPD (random amplified polymorphic DNA) проводили на амплификаторе T1 Thermocy-cler фирмы "Biometra" (Германия) с использованием "произвольных" праймеров 5-TTACTGC-GAACC-3', 5'-CAGGCCCTTC-3' и стандартных наборов для амплификации ДНК по следующей схеме: начальная денатурация (95°С, 2 мин); 2530 циклов амплификации : 1) денатурация - 95°С, 20 с; 2) отжиг: 32-33°С, 20 с; 3) элонгация - 72°С, 1 мин с удлинением времени на 2 с на каждый цикл; достраивание цепей ДНК - 72°С в течение 4 мин.
Определение нуклеотидных последовательностей ~900 пн амплификатов фрагментов генов 16S рРНК бактерий проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы "Applied Biosystems, Inc." (США) с помощью наборов "Big
Dye Terminator v.3.0", используя праймеры 5'-GCT AGC GTT GTT CGG AAT TAC-3' и 5-CCG AAC ATC TCA CGA CAC GA-3'.
Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы "DNASTAR, Inc." (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Опыт районирования козлятника восточного на территории России, и в частности в Башкортостане, показывает, что посев этой многолетней культуры без предварительной обработки семян препаратами ризобий малоэффективен. Растения в таких посевах медленно набирают массу, особенно в первые два года культивирования, клубеньки на их корнях появляются в небольших количествах только на третий год. Природу происхождения этих клубеньков мы исследовали на опытных полях Госсортоучастка с. Бузовьязы Кармаска-линского района Республики Башкортостан, где козлятник выращивается уже более десяти лет. Анализ растений 3-летних пос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.