ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 10, с. 1203-1206
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 576.316.599.323.5
СИНАПТОНЕМНЫЙ КОМПЛЕКС ДВУХ ВИДОВ РЫБ РОДА Nothobranchius (Cyprinodontidae)
© 2015 г. Л. Д. Сафронова, Е. Ю. Крысанов
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук, Москва 119071
e-mail: ldsafronova@gmail.com Поступила в редакциюб 18.12.2014 г.
Исследован кариотип самцов двух видов рыб рода Nothobranchius, с наименьшими для этого рода диплоидными числами: Nothobranchius rachovi (2N = 16) и Nothobranchius krysanov (2N = 18). Впервые получены и исследованы тотальные препараты распластанных синаптонемных комплексов (СК) этих видов. При окрашивании СК азотнокислым серебром и при иммуноокрашивании СК кроличьими антителами к белку SCP3 в ядрах сперматоцитов I порядка N. krysanovi и N. rachovi обнаружены 8 и 9 гомоморфных СК соответственно. Половые хромосомы не идентифицированы.
Ключевые слова: мейоз, синаптонемный комплекс, род Nothobranchius. DOI: 10.7868/S0016675815100148
Род ШШоЬтпсМт включает в себя 64 валидных вида рыб [1]. Представители этого рода населяют пресноводные водоемы Восточной Африки (от Эфиопии до ЮАР), пересыхающие во время засушливого сезона. В связи с чем эти виды обладают своеобразным жизненным циклом, для которого характерны короткое время жизни и способность икры к диапаузе. Некоторые представители этого рода с коротким жизненным циклом (3—5 месяцев) стали удобной моделью для исследования особенностей процесса старения. Кроме того, некоторые виды оказались достаточно удобными для использования в токсикологических тестах, особенно при изучении генотоксичности некоторых факторов окружающей среды.
В настоящее время исследованы кариотипы 12 видов рода ШЛоЬтпсЫш [2]. Внутри рода выявлена значительная вариабельность кариотипов. Кроме того, представители этого рода отличаются от большинства рыб других систематических групп уникально низким числом 2N и сравнительно большой длиной хромосом. Так, например, у N. гаекоу1 2N = 16, а у N./ыгзгп 2N = 38.
Однако детальная характеристика кариотипов этих видов не уточнена до настоящего времени. Мейоз у представителей данного рода практически не исследован. Только у одного вида рода, N. guentheri, выявлен половой гетероморфизм хромосом. У самцов N. guentheri 2N = 35, у самок 2N = 36. Авторами исследования сделано предположение, что у этого вида определение пола происходит по схеме Х1Х2У/Х1Х1Х2Х2 [3].
Для анализа мейотических хромосом и особенностей их синапсиса в профазе I мейоза у двух
видов рыб — ШШоЬтпсМт rachovi (2N = 16) и ШЛоЬтпсЫш к^апоу (2N = 18) нами использован метод кариотипирования на основе анализа синаптонемных комплексов Дрессера и Мозеса [4]. К настоящему времени этот метод получил широкое применение при исследовании мейоза у животных, человека, растений и грибов [3—6]. Получены тотальные препараты распластанных синаптонемных комплексов (СК) мейотических хромосом. Электронно-микроскопический анализ СК позволяет исследовать процесс синапсиса хромосом на ранних стадиях профазы I мейоза [4]. Количество СК в клетке равно гаплоидному набору хромосом. Сопоставление относительных длин СК аутосомных бивалентов в сперматоцитах и длин метафазных хромосом позволило установить идентичность морфометрических характеристик СК в сперматоцитах с длиной метафазных хромосом соматических клеток [4—6].
Исследованию мейоза у рыб с использованием анализа синаптонемных комплексов посвящено незначительное число работ [7—10].
В данном сообщении представлено описание СК двух видов рыб рода ШЛоЬтпсЫт, характеризующихся низким числом хромосом: у N. га-chovi — 2N = 16, у N. krysanovi — 2N = 18, которые не имеют гетероморфных половых хромосом [2].
Самцы двух видов рыб — ШЛоЬтпсЫш rachovi и ШЛоЬтпсЫш krysanov — были получены для исследования от членов клуба любителей нотобран-хиусов (killi.ru) и содержались в аквариумах ИПЭЭ им. А.Н. Северцова РАН.
Препараты соматических хромосом готовили из клеток предпочек самцов рыб после предвари-
1204 САФРОНОВА, КРЫСАНОВ
it
M
I
а b
M
12345 1 2 3 45
CM
CM
6 7 8 6 7
a IÄ a ЙС-
9 8 ,
а b
Рис. 1. Кариотипы самцов, приготовленные из клеток предпочки самцов N. krysanovi2N = 18 (а); N. rachovi2N = 16 (б).
Рис. 2. Ядра сперматоцитов N. krysanovi (а) и N. rachovi (б), распластанные на стадии пахитены. Синаптонемные комплексы контрастированы азотнокислым серебром. Латеральные элементы СК полностью синаптированы. Половые биваленты не идентифицированы. Увел. х1250.
тельной инъекции 0.1%-ного раствора колхицина по методу [11] с некоторыми модификациями. Препараты окрашивали раствором Гимза и анализировали под микроскопом Axioplan Karl Zeiss.
Препараты тотальных распластанных ядер сперматоцитов N. rachovi и N. krysanov готовили из клеток семенников. Распластывание (спредирова-ние) сперматоцитов I порядка проводили на капле 0.5%-ного раствора NaCl. Препараты фиксировали 4% параформальдегида [4]. СК контрастировали 50%-ным раствором нитрата серебра. Клетки просматривали и фотографировали под световым микроскопом Leica. Длины СК ауто-сомных и половых бивалентов сперматоцитов измеряли с помощью программы Leica Application Suite v. 3 на цифровых микрофотографиях. Нумерацию СК бивалентов в кариотипе проводили в порядке убывания их линейных размеров.
Иммуноцитохимическое исследование. Первичные и вторичные антитела разводили в буфере PBS, содержащем 3% БСА, 0.05% тритона X-100 и 0, 0.01% азида натрия [12].
СК и осевые элементы хромосом рыб иммуно-окрашивали с помощью первичных кроличьих антител против основного белка СК — SCP3 (Abeam, Cambridge, UK). В качестве вторичных антител использовали козьи антитела против IgG кролика, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 488 (Invitrogen, USA). Препараты отмывали в PBS и заключали в среду Vectashield с красителем DAPI.
Митотические хромосомы двух видов Notho-branchius представлены на рис. 1,а, б. Кариотип N. krysanovi имеет в диплоидном наборе 18 хромосом (10 метацентрических, 6 субметацентриче-ских и 2 акроцентрических), число плеч равно 34 (рис. 1,а). Кариотип N. rachovi состоит из 16 хромосом (10 метацентрических, 4 субметацентри-ческих и 2 акроцентрических), число плеч равно 30 (рис. 1,б).
Исследование СК. Для СК-кариотипирования самцов N. rachovi и N. krysanovi были отобраны ядра сперматоцитов на стадии средней пахитены, окрашенные азотнокислым серебром (рис. 2,а, б).
СИНАПТОНЕМНЫЙ КОМПЛЕКС ДВУХ ВИДОВ РЫБ
1205
Раскладку и нумерацию СК бивалентов проводили в порядке убывания их линейных размеров. На основе анализа СК были обнаружены 8 СК бивалентов в ядрах сперматоцитов N. rachovi и 9 СК бивалентов в ядрах N. krysanovi, что соответствует стандартному диплоидному набору хромосом каждого из них.
Следует отметить, что на стадии пахитены все СК выглядели полностью синаптированными, половой бивалент не идентифицируется, как это наблюдается у животных с гетероморфными половыми хромосомами (рис. 2).
На рис. 3 представлено ядро сперматоцита N. га-chovi, распластанное на стадии ранней диплотены.
Измерения длин СК. Суммарная длина (Ь) составляла 175.1 мкм при среднеквадратической ошибке 14.8 мкм, Ь = 175.1 ± 14.8 мкм. При этом диапазон значений Ь в наборах — от 150.1 до 189.6 мкм. Средняя длина хромосом в наборах Ь = 21.9 ± 1.8 мкм и диапазон значений от 18.8 до 23.6 мкм.
Результаты исследования подтверждают корреляцию между морфометрическими характеристиками метафазных и мейотических хромосом
[4, 6].
Иммуноцитохимическое исследование СК в ядрах распластанных сперматоцитов I порядка N. rachovi и N. krysanovi идентифицированы с помощью кроличьих антител к С-концу мажорного белка латеральных элементов СК — 8СР3 человека (рис. 4).
Специфическое взаимодействие этих антител с СК рыб обусловлено высокой консервативностью этого белка у всех позвоночных. Более того, известно, что ортологи белка 8СР3 можно обнаружить даже у примитивных многоклеточных, например у гидры [13, 14].
Нам не удалось идентифицировать половые хромосомы ни при анализе митотических карио-типов, ни при анализе синапсиса хромосом в мейозе у самцов изученных нами видов рыб.
Следует подчеркнуть, что большое количество видов телеостов (костистых рыб) кариотипировано и в пределах этой группы отмечено высокое разнообразие половых хромосом. В кариотипах многих видов телеостов выявлены множественные половые хромосомы. Предполагается, что они обусловлены робертсоновскими слияниями [15].
У некоторых видов, как это отмечено и нами у N. rachovi и N. krysanovi, идентифицировать половые хромосомы не удается. Возможно, что половые хромосомы просто не существуют у этих видов, а их половая детерминация осуществляется полифакторно (или модулируется экологически). Нельзя исключить и того, что морфологически половой гетероморфизм хромосом не удается выявить цитологически [16].
Рис. 3. Ядро сперматоцита N. rachovi, распластанное на стадии ранней диплотены. Синаптонемные комплексы контрастированы азотнокислым серебром. СК вытянуты. Стрелкой отмечен десинапсис латеральных элементов СК. Половой бивалент не идентифицирован. Увел. х1250.
1
<<
Рис. 4. Ядро сперматоцита N. rachovi, распластанное на стадии пахитены. Синаптонемные комплексы им-муноокрашены с помощью первичных антител к мажорному белку SCP3 и вторичных антител, меченных флуорохромом Alexa Fluor 488. Увел. х1250.
Однако у самцов N. rachovi и N. krysanovi гомология всех пар хромосом подтверждается полным синапсисом хромосом в профазе I мейоза.
Анализ СК в дальнейшем планируется использовать для исследования особенностей синапсиса и рекомбинации хромосом у межвидовых гибридов в естественных популяциях рода Nothobranch-ius.
Авторы выражают благодарность научному сотруднику Научного центра неврологических исследований Е.Г. Ивашкину за помощь в проведении иммуноцитохимического исследования распластанных СК сперматоцитов самцов рыб.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wildekamp R. A world of killies. Amer. killifish Assoc., 2004.
2. Shidlovsky K.M., Watters B.R., Wildekamp R.H. Notes on annual killifish species Nothobranchius rachovi
1206
САФРОНОВА, КРЫСАНОВ
(
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.